免疫磁気ネガティブセレクションによる全血からの単球の単離

要約

出典:Plaisance-Bonstaff, K., et al.初代ヒト単球の単離、トランスフェクション、および培養。J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、免疫磁気陰性分離による全ヒト血液からの単球の単離を実演しています。単離された単球は、さらなるダウンストリーム分析に使用できます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 免疫磁気ネガティブセレクションによるヒト初代単球の単離

1. 40 mLの新鮮なヒト全血(HIV⁺患者または健常者から採取)を4本の10 mLエチレンジアミン四酢酸(EDTA)真空チューブ(チューブあたり10 mLの血液)に採取します。バイオセーフティキャビネットの下で滅菌技術を使用して、40 mLの血液すべてを1本の50 mLコニカルプロピレンチューブに移します。
2. 選択したヒト単球単離キット(材料表)の製造元のプロトコルに従って、キットに含まれている2 mLの単球単離カクテルを血液チューブに加えます。キットにも付属のボルテックス磁気ビーズを30秒間、血液のチューブに2mLを加えます。
   1. 利用可能な血液が40 mL未満の場合は、添加する試薬をスケールダウンします。.溶液を混合するには、プラスチック製の25 mL血清ピペットでピペットを上下に動かし、室温(RT)で5分間インキュベー
   トします。
3. 血液混合物を4本の50 mLチューブに均等に分離し、1 mM EDTAを含む30 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を各チューブに加えます。プラスチック製の25 mL血清ピペットでピペッティングで上下に混合します。
4. チューブをマグネットホルダーに10分間入れて、抗体標識磁気ビーズを取り出します。各チューブに1つずつ、合計4つのマグネットホルダーを同時に使用することで、各血液サンプルのインキュベーションと分離時間を一定に保つことができます。
5. ピペットを使用して、各チューブの中心から内容物を引き出します。赤血球(開始容量10mLの10%以下)を吸い上げないように注意し、内容物を4本の新しい50mLチューブのいずれかに入れます。
6. ボルテックスされた磁気ビーズ500 μLを各50 mLチューブに加えます。25 mLピペットでピペットを上下に動かし、室温で5分間インキュベートします。次に、チューブをマグネットホルダーに5分間入れます。
7. マグネットホルダーに入れたまま、各チューブの中央から内容物を4本の新しい50 mLチューブのいずれかに慎重に移します。新しい50 mLチューブをマグネットホルダーに直接5分間置きます。
8. 各チューブの中央から内容物を4つの新しい50 mLチューブのいずれかに慎重に移します。すべての新しい50 mLチューブを300 x gで5分間遠心します。上清を吸引し、4つの細胞ペレットすべてを合計10 mLの滅菌PBSに再懸濁します。
9. 血球計算盤を用いたトリパンブルー排除による細胞のカウント.
   注:8-20 x 10⁶細胞は、通常、全血40mLから得られます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5M EDTAの	インビトゲン	AM9260G
BD Vacutainer プラスチック採血チューブK2EDTA 付き	BDバイオサイエンス	366643
イージー50イージーセップマグネット	StemCellテクノロジー	18002
Easy Sep Direct ヒト単球単離キット	StemCellテクノロジー	19669
PBSの	ギブコ	20012027
RPMI 1640 と L-グルタミン	コーニング	10040CVMPの

年