初代単球のin vitro培養とマクロファージへの分化

要約

出典: Plaisance-Bonstaff, K., et al. Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes. J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオは、初代単球のマクロファージへのプライミングを示しています。初代ヒト単球は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を使用してM1様炎症誘発性表現型に、またはマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を使用してM2様抗炎症表現型に単離および分化することができます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 免疫磁気ネガティブセレクションによるヒト初代単球の単離

1. 40 mLの新鮮なヒト全血(HIV⁺患者または健常者から採取)を4本の10 mLエチレンジアミン四酢酸(EDTA)真空チューブ(チューブあたり10 mLの血液)に採取します。バイオセーフティキャビネットの下で滅菌技術を使用して、40 mLの血液すべてを1本の50 mLコニカルプロピレンチューブに移します。
2. 選択したヒト単球単離キット(材料表)の製造元のプロトコルに従って、キットに含まれている2 mLの単球単離カクテルを血液チューブに加えます。キットにも付属のボルテックス磁気ビーズを30秒間、血液のチューブに2mLを加えます。
   1. 利用可能な血液が40 mL未満の場合は、添加する試薬をスケールダウンします。.溶液を混合するには、プラスチック製の25 mL血清ピペットでピペットを上下に動かし、室温(RT)で5分間インキュベー
   トします。
3. 血液混合物を4本の50 mLチューブに均等に分離し、1 mM EDTAを含む30 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を各チューブに加えます。プラスチック製の25 mL血清ピペットでピペッティングで上下に混合します。
4. チューブをマグネットホルダーに10分間入れて、抗体標識磁気ビーズを取り出します。各チューブに1つずつ、合計4つのマグネットホルダーを同時に使用することで、各血液サンプルのインキュベーションと分離時間を一定に保つことができます。
5. ピペットを使用して、各チューブの中心から内容物を引き出します。赤血球(開始容量10mLの10%以下)を吸い上げないように注意し、内容物を4本の新しい50mLチューブのいずれかに入れます。
6. ボルテックスされた磁気ビーズ500 μLを各50 mLチューブに加えます。25 mLピペットでピペットを上下に動かし、室温で5分間インキュベートします。次に、チューブをマグネットホルダーに5分間入れます。
7. マグネットホルダーに入れたまま、各チューブの中央から内容物を4本の新しい50 mLチューブのいずれかに慎重に移します。新しい50 mLチューブをマグネットホルダーに直接5分間置きます。
8. 各チューブの中央から内容物を4つの新しい50 mLチューブのいずれかに慎重に移します。すべての新しい50 mLチューブを300 x gで5分間遠心します。上清を吸引し、4つの細胞ペレットすべてを合計10 mLの滅菌PBSに再懸濁します。
9. 血球計算盤を用いたトリパンブルー排除による細胞のカウント.
   注:8-20 x 10⁶細胞は、通常、全血40mLから得られます。

2. 初代ヒト単球の培養

1. 37°Cのウォーターバスを使用して、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(ペン/連鎖球菌)を添加した温かい無血清RPMI 1640培地を使用し、(バイオセーフティキャビネットの下で滅菌技術を使用し続けながら)この培地に単離された単球を1 x 10⁶細胞/mLの濃度で再懸濁します。
2. 1 mLの再懸濁細胞を6ウェルプレートの各ウェルまたは35 mmディッシュ(最終的な細胞数は1 x 10⁶細胞/プレート)に加え、5% CO₂を含む37°Cインキュベーターに入れます。細胞が付着するまで0.5〜1.0時間待ちます。
3. 37°Cのウォーターバスを使用して、温かい熱不活化(HI)ウシ胎児血清(FBS)を添加します。各プレートに100 μL(最終濃度10%)のFBSを加えます。細胞に成長因子を添加して、マクロファージの分化を促進します。
   1. 25 ng/mLの顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を培地に添加することにより、M1様表現型のためのプライムマクロファージ。50 ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を培地に添加することにより、M2様表現型のためのプライムマクロファージ
      手記：GM-CSFとM-CSFはどちらも、単球を一般的なマクロファージ表現型(M0)に分化させながら、それぞれ細胞をM1またはM2にプライミングします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5M EDTAの	インビトゲン	AM9260G
BD Vacutainer プラスチック採血チューブ K2EDTA 付き	BDバイオサイエンス	366643
イージー50イージーセップマグネット	StemCellテクノロジー	18002
Easy Sep Direct ヒト単球単離キット	StemCellテクノロジー	19669
胎児ボビン血清定義熱不活性化	ハイクロン	SH30070.03HI
Nunc 35mm細胞培養ディッシュ	サーモサイエンティフィック	150318
PBSの	ギブコ	20012027
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140122
組換えヒトGM-CSF	R&Dシステム	215-GM-050
組換えヒトM-CSF	R&Dシステム	216-MC-025
RPMI 1640 と L-グルタミン	コーニング	10040CVMPの

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