標的化学物質の効果を研究するための肥満細胞脱顆粒アッセイ

要約

出典:Tsvilovskyy, V., et al. Ca²⁺イメージングおよび脱顆粒アッセイによる腹膜由来マスト細胞の単離とその機能特性評価。J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、肥満細胞の脱顆粒活性を測定するための比色分析を実演しています。肥満細胞によって放出された酵素は、基質を加水分解し、着色された製品を生成します。肥満細胞の脱顆粒活性は、細胞外への酵素の放出率を細胞内の総酵素含有量で正規化して測定しました。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腹腔内洗浄によるPMCの単離と培養

1. 腹腔内洗浄によるPMCの単離
   1. 細胞単離に先立ち、表1に記載されている材料を調製します。
   2. PMCの分離には、8〜14週齢の雄マウスを使用します。CO2吸入によりマウスを安楽死させ、反射神経の喪失により死亡を確認する。マウスに70%エタノールをスプレーし、ピン(背側を下にして)を使用してフォームブロックに固定します。鈍い刃のはさみを使用してマウスの腹側皮膚を取り除きます。腹腔を傷つけないようにしてください。
      手記：通常、このプロトコルは、C57BL/6N株の遺伝的背景を持つマウスに使用します。
   3. 27 Gの針を備えた10 mLのシリンジを使用して、7 mLの氷冷RPMI培地と5 mLの空気を腹腔に注入します。針を腹膜に慎重に押し込み、臓器に穴を開けないでください。精巣上体脂肪の領域のスポットを使用して、臓器穿孔のリスクを減らします。
   4. 注入後、マウスを1分間振とうして、腹膜細胞をRPMI培地に剥離します。内臓の損傷や腹腔の血液汚染を避けるために、マウス....

結果

図1:野生型マウスから単離したPMCを用いて実施されたβ-ヘキソサミニダーゼ放出比色マルチウェル測定。(A)β-ヘキソサミニダーゼアッセイを実施するための96ウェルプレートピペッティングの刺激スキーム;「Spontan」は、分泌促進物質を添加せずにTyrode's Solutionをピペッティングすることに対応しています。IM = イオノマイシン;Cp 48/80 = コンパウンド 48/80。(B)イオノマイシン(IM)、ジニトロフェノール-ヒト血清アルブミン(DNP)、および化合物48/80(Cp 48/80)を指示濃度で刺激した後の基礎条件(Spont)下でのβ-ヘキソサミニダーゼ放出の割合を示す棒グラフ。アッセイは二重に実施しました。エラーバーは、平均の標準誤差を示します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMIミディアム	サーモサイエンティフィック	21875034
DPBSの	シグマ・アルドリッチ	14190144
FCSの	サーモサイエンティフィック	R92157
IL-3	R&Dシステム	403ミリリットル
SCFの	サーモサイエンティフィック	PMC2115
DNP-HSAの	シグマ・アルドリッチ	A6661 (英語
抗DNP抗体	シグマ・アルドリッチ	D-8406
ペンストレップ	サーモサイエンティフィック	15140122
コンパウンド48/80	シグマ・アルドリッチ	C2313
4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニルポリエチレングリコール	シグマ・アルドリッチ	X100
4-ニトロフェニル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシド	シグマ・アルドリッチ	N9376
CoverWellイメージングチャンバー	シグマ・アルドリッチ	GBL635051
96ウェルプレート、V字型底部	コーニング	3896
96ウェルプレート、平底	グライナーバイオワン	655180
マイクロタイタープレートリーダー 「i-control」ソフトウェア	テカン	ナノクォンツ、インフィニットM200プロ
フラットボトムプレート	グライナーバイオワン	655180
イオノマイシン	シグマ・アルドリッチ	I9657
50 mLプラスチック遠心チューブ	ザルシュテット	62.547.254
培養フラスコ(25 cm)	グライナーバイオワン	69160
血球計算盤	VWRの	〒631-0696
単色光源	サッターインストゥルメント	ラムダ DG-4
15 mLプラスチック遠心チューブ	ザルシュテット	6,25,54,502
ベンチ遠心分離機	ヘレウス	メガフュージ 1.0R

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