標的化学物質の効果を研究するための肥満細胞脱顆粒アッセイ

要約

出典:Tsvilovskyy, V., et al. Ca²⁺イメージングおよび脱顆粒アッセイによる腹膜由来マスト細胞の単離とその機能特性評価。J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、肥満細胞の脱顆粒活性を測定するための比色分析を実演しています。肥満細胞によって放出された酵素は、基質を加水分解し、着色された製品を生成します。肥満細胞の脱顆粒活性は、細胞外への酵素の放出率を細胞内の総酵素含有量で正規化して測定しました。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腹腔内洗浄によるPMCの単離と培養

1. 腹腔内洗浄によるPMCの単離
   1. 細胞単離に先立ち、表1に記載されている材料を調製します。
   2. PMCの分離には、8〜14週齢の雄マウスを使用します。CO2吸入によりマウスを安楽死させ、反射神経の喪失により死亡を確認する。マウスに70%エタノールをスプレーし、ピン(背側を下にして)を使用してフォームブロックに固定します。鈍い刃のはさみを使用してマウスの腹側皮膚を取り除きます。腹腔を傷つけないようにしてください。
      手記：通常、このプロトコルは、C57BL/6N株の遺伝的背景を持つマウスに使用します。
   3. 27 Gの針を備えた10 mLのシリンジを使用して、7 mLの氷冷RPMI培地と5 mLの空気を腹腔に注入します。針を腹膜に慎重に押し込み、臓器に穴を開けないでください。精巣上体脂肪の領域のスポットを使用して、臓器穿孔のリスクを減らします。
   4. 注入後、マウスを1分間振とうして、腹膜細胞をRPMI培地に剥離します。内臓の損傷や腹腔の血液汚染を避けるために、マウスを強く振らないでください。
   5. 10 mLシリンジに新しい20 Gカニューレを装備して再利用します。フォームブロックを傾け、ベンチで軽くたたいて内側の臓器を片側にずらし、反対側から中程度の吸引を容易にします。20 Gの針を挿入し、斜めにし、腹部から液体を穏やかかつゆっくりと(~0.5 mL / s)吸引して、内臓による詰まりを防ぎます。.できるだけ多くの水分(通常は5〜6 mL)を収集します。
   6. シリンジから針を取り出し、採取した細胞懸濁液を氷上の採取チューブに移します。目に見える血液汚染がある場合は、サンプルチューブを廃棄してください。
   7. 細胞懸濁液を入れたチューブを~300 x gで5分間遠心分離します。滅菌フードの下で上清を吸引します。各マウスについて、サンプルペレットを4 mLの冷(4–10 °C)PMC培地に混合し、細胞懸濁液を25 cm²の培養フラスコに移します。成長因子IL-3とSCFをそれぞれ最終濃度10 ng/mLと30 ng/mLに添加します。細胞が入ったフラスコをインキュベーター(37°C、5%CO₂)に入れ、次の手順まで~48時間インキュベー
   トします。
2. PMCの文化
   1. 2日目(隔離後~48時間後):中程度の変化
      1. 上清細胞と非接着細胞(赤血球と死細胞)を除去するには、パスツールピペットチップをフラスコの端に置き、フラスコをほぼ水平に保持して、フラスコから培地を吸引します。マウス1匹につき4 mLの予熱済みPMC Mediumを添加します。成長因子IL-3(10 ng/mL)およびSCF(30 ng/mL)を添加します。細胞の入ったフラスコをインキュベーター(37°C、5%CO₂)に入れます。
   2. 9日目:細胞分裂
      1. 細胞懸濁液を細胞培養フラスコから50 mLのプラスチック遠心チューブに移します。フラスコを10 mLの予熱済み(37 °C)ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で3回洗浄し、分離した細胞と細胞懸濁液を同じ50 mLプラスチック遠心チューブに集めます。血球計算盤で細胞濃度をカウントし、細胞の総数を計算します。
      2. 細胞懸濁液を~300 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引します。ペレットを予温したPMC培地(37°C)で回収し、細胞濃度1 x 10⁶細胞/mLを得ます。細胞懸濁液を新しい25 cm²培養フラスコに移します。底に線維芽細胞が付着している古いフラスコを捨てます。
      3. 成長因子IL-3(10 ng/mL)とSCF(30 ng/mL)を添加し、細胞が入ったフラスコをインキュベーター(37°C、5% CO₂)に入れます。
   3. 12〜15日目:細胞測定
      1. FcɛRI受容体の刺激実験を計画している場合は、標準的な培地で300 ng/mLのIgE抗DNPで細胞を一晩前処理します。

2. PMCsにおけるβ-ヘキソサミニダーゼ放出測定

1. 測定に先立ち、表2に示す材料を準備します
   注:MCから放出されたβ-ヘキソサミニダーゼは、刺激後にp-ニトロフェニル-アセチル-D-グルコサミン(pNAG)をp-ニトロフェノールとN-アセチル-D-グルコサミンに加水分解します。サンプル中のβ-ヘキソサミニダーゼの量は、形成されるp-ニトロフェノールの量に比例します。「Stop Solution」の高pH環境では、p-ニトロフェノールは完全に脱プロトン化されたp-ニトロフェノールとして存在し、405 nmの光吸光度によって検出できます。
2. 130 mM NaCl、5 mM KCl、1.4 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM HEPES、5.6 mMグルコース、およびBSA 0.1%を含むTyrode溶液を調製します。pHを7.4に調整し、3 M NaOHを使用します。
3. Tyrodeの溶液に1%容量のTriton X-100を加えて、溶解液を調製します。
4. 200 mMグリシンからなる停止溶液を調製し、NaOHでpHを10.7に調整します。
5. pNAGを0.4Mクエン酸に最終濃度4mMまで溶解することにより、pNAG溶液(4-ニトロフェニル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシド)溶液を調製します。
6. アッセイに必要な細胞の量を計算します(アッセイを二重に実行します)。井戸ごとに200,000個のPMCを使用します。ネガティブコントロールとして2ウェル(DNPや化合物48/80などの分泌促進物質を含まないタイロード溶液)とポジティブコントロールとして2ウェル(10μMイオノマイシンを含むタイロード溶液)をすべての遺伝子型に使用します。
7. 細胞を15 mLのプラスチック製遠心チューブに移し、Tyrode溶液で容量を15 mLに調整し、200 x gで4分間遠心分離します。
8. ウェルあたり100 μLの細胞懸濁液を96ウェルのV底ウェルプレートに移します。各ウェルに25 μLの刺激溶液または制御溶液を添加します(図1Aに示すピペッティングスキームによる)。細胞を37°Cおよび5%CO₂で45分間インキュベートします。
9. 96ウェルプレートを氷上に5分間置いて反応を停止します。次に、プレートを4°Cで120 x gで4分間遠心分離します。マルチチャンネルピペットを使用して上清120μLを平底の96ウェルプレートに移し、氷の上に置きます。細胞ペレットに触れないように注意しながら、上清を完全に吸引します。
10. 125 μLの溶解バッファーを細胞ペレットに加えます。細胞ペレットを室温で5分間インキュベートし、インキュベーション後、ピペッティングを繰り返して(約5回)再懸濁します。
11. 新しい平底96ウェルプレートの必要なウェルにpNAG溶液(4 mM)の25 μLをピペットで入れます。調製したpNAG溶液に各上清から25 μLを添加し、各細胞ライセートを25 μL加えます。
12. 反応バッチを37°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルに150μLの停止溶液をピペットで注入し、反応を停止させます。
13. マイクロプレートリーダーで、405 nmのデュアル波長設定とリファレンス630 nmを使用してプレートを分析し、自動バックグラウンド減算を行います。取得プログラムで「参照」ボックスにチェックを入れ、「吸光度」プログラム要素メニューでドロップダウンリストから「630 nm」を選択します。サンプルの光学密度が高すぎる場合は、再測定する前にプローブの適切な希釈を準備してください。

>表 1: ステップ 1 の資料。

名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名

1	氷
2	10 mLシリンジ
3	27G針
4	20Gの針
5	発泡スチロールのブロックとピン
6	収集チューブ(50 mLプラスチック遠心分離チューブ)
7	70%エタノール
8	RPMI Medium (事前に冷やして氷上に保管)
9	PMCミディアム:RPMIミディアム+ 20%FCS(子牛胎児血清)+ 1%ペニシリンストレプトマイシン溶液(ペン連鎖球菌)
10	ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 - DPBS(Ca2+およびMg2+なし)
11	培養フラスコ(25 cm)
12	成長因子ストック溶液(IL-3:1μg/μL;SCF:2.5μg/mL)
13	血清ピペット(10 mL)
14	ピペットチップは滅菌済み(20–200 μL)
15	血球計算盤
16	ベンチ遠心分離機
17	はさみと鉗子
18	マウス用CO2チャンバー
19	オープン滅菌フード
20	密閉型滅菌フード
21	セルインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)
22	トランスファーピペット(20–200 μL)

>表 2: ステップ 2 の資料。

名 名 名 名 名 名 名

1	PMC(12〜15日齢)1 x 106細胞/ mL
2	抗DNP抗体 (IgE) ストック溶液
3	DNP-HSAストックソリューション
4	コンパウンド48/80ストック溶液
5	イオノマイシン
6	96ウェルプレート、V字型底部
7	96ウェルプレート、平底
8	プラスチック遠心チューブ(15mL)
9	血清ピペット
10	セルインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)
11	ベンチ遠心分離機
12	光学密度測定用のマイクロタイタープレートリーダー
13	マルチチャンネルピペット (20–200 μL)
14	血球計算盤

結果

図1:野生型マウスから単離したPMCを用いて実施されたβ-ヘキソサミニダーゼ放出比色マルチウェル測定。(A)β-ヘキソサミニダーゼアッセイを実施するための96ウェルプレートピペッティングの刺激スキーム;「Spontan」は、分泌促進物質を添加せずにTyrode's Solutionをピペッティングすることに対応しています。IM = イオノマイシン;Cp 48/80 = コンパウンド 48/80。(B)イオノマイシン(IM)、ジニトロフェノール-ヒト血清アルブミン(DNP)、および化合物48/80(Cp 48/80)を指示濃度で刺激した後の基礎条件(Spont)下でのβ-ヘキソサミニダーゼ放出の割合を示す棒グラフ。アッセイは二重に実施しました。エラーバーは、平均の標準誤差を示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMIミディアム	サーモサイエンティフィック	21875034
DPBSの	シグマ・アルドリッチ	14190144
FCSの	サーモサイエンティフィック	R92157
IL-3	R&Dシステム	403ミリリットル
SCFの	サーモサイエンティフィック	PMC2115
DNP-HSAの	シグマ・アルドリッチ	A6661 (英語
抗DNP抗体	シグマ・アルドリッチ	D-8406
ペンストレップ	サーモサイエンティフィック	15140122
コンパウンド48/80	シグマ・アルドリッチ	C2313
4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニルポリエチレングリコール	シグマ・アルドリッチ	X100
4-ニトロフェニル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシド	シグマ・アルドリッチ	N9376
CoverWellイメージングチャンバー	シグマ・アルドリッチ	GBL635051
96ウェルプレート、V字型底部	コーニング	3896
96ウェルプレート、平底	グライナーバイオワン	655180
マイクロタイタープレートリーダー 「i-control」ソフトウェア	テカン	ナノクォンツ、インフィニットM200プロ
フラットボトムプレート	グライナーバイオワン	655180
イオノマイシン	シグマ・アルドリッチ	I9657
50 mLプラスチック遠心チューブ	ザルシュテット	62.547.254
培養フラスコ(25 cm)	グライナーバイオワン	69160
血球計算盤	VWRの	〒631-0696
単色光源	サッターインストゥルメント	ラムダ DG-4
15 mLプラスチック遠心チューブ	ザルシュテット	6,25,54,502
ベンチ遠心分離機	ヘレウス	メガフュージ 1.0R

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