マウスクッパー細胞の単離と培養

要約

出典:Bourgognon, M., et al. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、マウスの肝臓からKupffer細胞または肝臓マクロファージを分離する方法を示します。肝臓に消化溶液を灌流し、続いて密度勾配分離を行います。単離された接着性Kupffer細胞は、さらなる分析に使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 灌流と細胞採取(図1)

1. 材料表に記載されているすべての試薬を新たに調製します。
2. EGTA溶液(エチレングリコール四酢酸)/HBSS(ハンクス平衡塩溶液)溶液(マウスあたり50ml)とコラゲナーゼ溶液(マウスあたり100ml)を40°Cで30分間温めます。
3. 最初にポンプのフレキシブルチューブを70%エタノールですすいでください。ウォーターバスに浸した遠心分離チューブに40 mlのEGTA/HBSS溶液を注ぎ、事前に温めたEGTA / HBSS溶液でポンプのフレキシブルチューブをすすぎます。
4. バルビツール酸を使用して終末麻酔を行い、呼吸抑制や死亡前に確実に意識を失わせます。フェノバルビトンを1 mg / kgで注射します。i.p. 雌または雄のCD1マウス(35-45 g)。.つま先をつまんで麻酔を確認します。
5. 腹部の毛を剃り、70%エタノール溶液を使用して腹部表面を滅菌します。
6. 腹腔内を切開し、腸を腹部の左側に横方向に動かして門脈と下大静脈を露出させます。
7. EGTA/HBSS溶液でポンプを1〜3 ml / minの速度で始動し、23 gのバタフライ針(ウィングカット)を使用して門脈をカニューレします。23G針でカニューレを挿入した門脈の部分をクランプし、開いたマウス腹部の表面でセレフィン鉗子を反転させます。肝臓は、EGTA/HBSS溶液の灌流の最初の30秒以内にすぐに青白くなるはずです。
8. 肝臓に過剰な圧力がかかるのを避けるために、下大静脈の下部を急速に切開し、その後、灌流の最初の1分間で流量を徐々に7 ml / minに増やします。.動物は大静脈静脈穿刺に続発する出血により死亡します。
9. 遠心チューブに残っているEGTA/HBSS溶液が5 ml未満の場合は、コラゲナーゼ溶液(40-50 ml)で満たします。流量を10 ml / minまで30秒かけて徐々に増やします。
10. ピンセットを使用して、下大静脈に圧力を5〜10秒間隔で加えて、肝臓を腫脹させます。これは定期的に行うことができます(消化中に5〜10回)。このステップにより、肝細胞の解離が改善され、コラゲナーゼによる灌流時間が短縮されます。
11. 遠心チューブ内に残っているコラゲナーゼ溶液が10 mL未満の場合は、予熱したコラゲナーゼ溶液40〜50 mLを遠心チューブに注ぎます。
12. 10〜15分間の灌流と約70〜80mlのコラゲナーゼ溶液灌流後、鉗子で肝臓の表面に小さな圧力をかけます。圧力のプリントは、肝細胞が解離していることを示しています。
13. 肝臓を腹腔から一体で取り出し、20〜30 mlのKupffer Cells Isolation Mediumが入った遠心チューブに入れます。肝細胞を氷上または4°Cで最大3時間保持して、肝細胞の生存率に影響を与えないようにします。
14. 必要に応じて、灌流した肝臓を氷上に置きながら、いくつかの動物で灌流手順を繰り返します。精製のために1〜3個の肝臓をプールし、ステージ3に進みます。

2. 遠心分離用密度グラジエントの準備(図2)

1. 無菌条件下で次の手順(セクション2、3、5)に進み、細胞を氷上または4°Cに保ちます。15.3 mlのコーティングされたシリカ粒子溶液と10 x PBSの1.7 mlを混合して、SIP(Solution of Isotonic coated silica Particles)を準備します。
2. 20 mlの25%SIP溶液を作るには、5 mlのSIPと15 mlのPBSを混合します。20mlの50%SIP溶液を作るには、10mlのSIPと10mlのPBSを混合します。
3. 1本の遠心チューブに20mlの50%SIP溶液を入れます。遠心分離チューブを90°に近い角度に傾け、25 mLの血清ピペットを使用して、50% SIP層の表面に触れずに、チューブの側壁に25% SIP溶液(20 ml)をゆっくりと加えます。25% SIP溶液を追加するときは、チューブの角度を徐々に小さくします。密度勾配は、使用時まで氷の上に置いてください。

3. クッパー細胞の精製(図3)

1. 灌流した肝臓1つを、15 mLのKupffer Cell Isolation Mediumを入れたシャーレに入れます。はさみを使用してグリッソン嚢(肝臓の膜)を破裂させ、すべての肝細胞をクッパー細胞単離培地に放出します。100 μmのセルストレーナーで溶液をろ過し、遠心分離チューブに集めます。追加の灌流肝臓で灌流手順を繰り返し、同じ遠心チューブに細胞をプールします(1匹のマウスから15 ml、3匹のマウスから最大45 ml)。
2. 細胞懸濁液を50 x gで2分間、4°Cで遠心分離します。実質細胞(肝細胞)はペレット中にあり、非実質細胞(Kupffer細胞を含む)は上清中にあります。
3. 上清を清潔な遠心チューブに集め、50 x gで各2分間遠心分離します。この手順をさらに 3 回繰り返します。
4. 1,350 x gで15分間遠心分離し、非実質細胞をペレット化します。上清を捨て、ペレットを10 mLのKupffer Cell Isolation Mediumに再懸濁します。
5. 2.3で説明したように、不連続な等張勾配25/50%に非実質細胞溶液を添加します。850 x gで15分間、加速または中断せずに遠心分離します。
6. 25/50% SIPインターフェースに近い25% SIP画分内で濁って見える濃縮Kupffer細胞画分を局在化します(図3)。10 mLの血清ピペットを使用して、濃縮されたKupffer細胞画分を約12 mL吸引します。細胞を35〜40 mlのKupffer Cell Isolation Mediumを含む遠心チューブに移します。穏やかに混合し、1,350 x gで4°Cで15分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
7. 上清を捨て、温めた5〜10 mLのKupffer Cell Culture Mediumに細胞を再懸濁します。細胞をカウントし(血球計算盤)、トリパンブルー染色を使用して生存率を測定します。
8. 精製した非実質細胞を24ウェルプレートに5 x 10⁵細胞/ウェルの密度でプレートします。細胞を37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします(図3)。30分後、培地を静かに取り出し、あらかじめ温めたHank's Balanced Salt Solution(HBSS)で一度洗浄し、500 μlの新鮮であらかじめ温めたKupffer Cell Culture Medium(ウェルあたり)と交換します。

結果

図1:肝臓灌流。マウスの麻酔後、消化管を腹部の左側に横方向に動かして、門脈(PV)にアクセスできるようにします。PVは、EGTA/HBSS溶液の低速流速(1〜3 ml / min)を使用してカニューレされ、下大静脈(IVC)は肝臓内の過剰な圧力を避けるためにすぐに破裂します。灌流の最初の1分以内に、流速は徐々に7 mL/minに増加します。その後、コラゲナーゼ溶液を10 mL/分で灌流し、完全に消化するまで行います。

図2:密度勾配の準備。すべての手順は無菌条件下で...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ユータタール(ペントバルビタールナトリウム)	メリアル
CD1マウス	チャールズ川	-	マウスの体重は35〜45 gです。体重が急激に増加するため、雄のCD1マウスの使用をお勧めします(例:7週齢の雄のCD1マウスの体重が35 gを超える)。また、高齢の動物の配送を手配するために、事前に動物の供給業者に連絡することをお勧めします。あるいは、動物を室内で飼って目的の体重にすることもできます。
HBSS(Ca2+およびMg2+フリー、重炭酸塩を含む)	ライフテクノロジー	14175-053	HBSSはCa2+フリーでなければなりません。
エチレングリコール四酢酸(EGTA)四ナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	E8145	EDTAも使用できますが、EGTAにはCa2+を選択的にキレート化する利点があります。
HEPESの(1M)	ライフテクノロジー	15630から056	100ミリリットル
コラゲナーゼIV型	ワージントン	CSL-4	コラゲナーゼの異なるバッチをテストするか、少なくとも製品が肝細胞の単離に適している必要があることをサプライヤーに伝えることをお勧めします
低グルコースDMEM	シグマ・アルドリッチ	D5523	500ミリリットル
RPMI(ピルビン酸ナトリウムとグルタマックス®を含む)	ライフテクノロジー	〒12633-012	500ミリリットル
ペニシリン/ステプトマイシン	ライフテクノロジー	15140-122	100ミリリットル
ウシ胎児血清	ファーストリンク	60-00-850	500ミリリットル
トリパンブルー溶液	シグマ・アルドリッチ	T8154	100ミリリットル
被覆シリカ粒子溶液(パーコール®)	GEホールトケア	〒17-0891-02	パーコール®は非常に安定しており、数年間保管することができます
1 x リン酸緩衝生理食塩水	ライフテクノロジー	〒10010-023	500ミリリットル
10x リン酸緩衝生理食塩水	ライフテクノロジー	〒70011-036	500ミリリットル
蝶採血セット(23G / 305mmロングチューブ)	BDの	367288
シリンジフィルター(0.22μmブルーリム)	ミニサート	16534-K
遠心分離チューブ(50mlブルーキャップ)	BDバイオサイエンス、ファルコン	35 2070
ペトリ皿(90 x 15 mm)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BSN 101VR20
100 μmセルストレーナー	BDの	352360
蠕動ポンプ	ワトソン・マーロウ	サイQ 300	各使用の前後に、滅菌PBSと70%エタノールでチューブをすすぎます。
24ウェルプレート	コーニング	3526
遠心機	エッペンドルフ	5810R型
セレフィン鉗子	ハンマッハーGmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	serrefine鉗子は、灌流手順中に鉗子を保持することなく、23G針でカニューレされた血管をクランプすることを可能にします。URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
セルスクレーパー	BDバイオサイエンス、ファルコン	353086	ハサミで刃の先端を切断し、24ウェルプレートの細胞をこすり落とします。
EGTA®(エチレングリコール四酢酸)/HBSS(ハンクス平衡塩溶液)液			0.5 mM EGTAおよび25 mM HEPESを含むHBSS。pHを7.4に調整します。灌流する肝臓ごとに50mlを準備します。
コラゲナーゼ溶液			100 UI/ml、15 mM HEPES、および 1% ペニクリン/ストレプタマイシン (v/v) のコラゲナーゼ IV 型を含む DMEM 低グルコース。pHを7.4に調整します。灌流する肝臓ごとに100mlを準備します。コラゲナーゼを追加した後、使用前に溶液を30分間温めることをお勧めします。これにより、コラゲナーゼ活性を最適にすることができます。
Kupffer Cell Isolation 培地			RPMI には、1% の非必須アミノ酸 (v/v)、1% グルタマックス® (v/v)、1% のペニクリン/ストレプトマイシン (v/v) が含まれています。1〜3個の肝臓に少なくとも100mlを準備します。
Kupffer細胞培養培地			10% のウシ胎児血清、1% の非必須アミノ酸 (v/v)、1% グルタマックス® (v/v)、1% ペニクリン/ストレプタマイシン (v/v) を含む RPMI。1〜3個の肝臓に少なくとも100mlを準備します。
SIP(等張コーティングされたシリカ粒子の溶液)			1.7 mLの10x Phosphate Buffered Salineを15.3 mLのPercoll®と混合して、17 mLのSIPを得ます。
25% SIPソリューション			5 mLのSIPと15 mLの1x Phosphate Buffered Salineを混合します。
50%SIPソリューション			10 mLのSIPと10 mLの1x Phosphate Buffered Salineを混合します。
溶解バッファー			0.9% Triton X-100 を含む DMEM メディア
PBS/BSAソリューション			新鮮なリン酸緩衝生理食塩水pH 7.4を1%ウシ血清アルブミンと共に調製します。

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