ヒト誘導多能性幹細胞のマクロファージへの分化

要約

出典:Lopez-Yrigoyen, M., et al.多能性幹細胞からのヒトマクロファージの産生と特性評価。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からマクロファージを生成するためのin vitro法について説明しています。iPS細胞からのマクロファージの生成は、(i)懸濁液中でiPS細胞が凝集して三次元胚様体(EB)を形成し、中胚葉細胞に分化する、(ii)分化したEBからマクロファージ前駆細胞が形成される、(iii)マクロファージ前駆細胞が成熟した機能マクロファージに分化する、の3つの段階で行われます。

プロトコル

1. ヒトiPS細胞のマクロファージへの分化

>注:マクロファージ分化プロトコルの概略的な要約を図1に示します。

1. 細胞分化、増殖因子、その他の試薬の調製
   1. ヒト胚性幹細胞無血清培地(hESC-SFM;資料の表を参照)ダルベッコの修飾イーグル培地-F12(DMEM/F12)にhESCサプリメント、1.8%w / vウシ血清アルブミン(BSA)、および0.1mM 2-メルカプトエタノールを補給します。
   2. ブタゼラチンを滅菌水に溶解することにより、ブタゼラチンの0.1%w / v溶液を調製します。ゼラチン溶液は、4°Cで最大2年間保存できます。
   3. BMP4を4 mM塩化水素(HCl)-0.2%BSA PBS溶液に溶解して、ヒト骨形成タンパク質(BMP4)ストック溶液(25 μg / mL)を調製します。ストック溶液を50 μLアリコートとしてクライオチューブに分配します。ストック溶液は、-20°Cで最大1年間保存できます。解凍後、ストックBMP4は4°Cで5日間保存できます。
   4. VEGFを0.2%BSA PBS溶液に溶解することにより、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)ストック溶液(100 μg / mL)を調製します。ストック溶液を10 μLアリコートとしてクライオチューブに分配します。ストック溶液は、-20°Cで最大1年間保存できます。解凍後、ストックVEGFは4°Cで7日間保存できます。
   5. ヒト幹細胞因子(SCF)ストック溶液(100 μg/mL)を調製するには、SCFを0.2% BSA PBS溶液に溶解します。ストック溶液を5 μLアリコートとしてクライオチューブに分配します。ストック溶液は、-20°Cで最大1年間保存できます。解凍後、ストックSCFは4°Cで10日間保存できます。
   6. IL3を0.2% BSA PBS溶液に溶解して、ヒトインターロイキン-3(IL3)ストック溶液(10 μg/mL)を調製します。ストック溶液を500 μLアリコートとしてクライオチューブに分配します。ストック溶液は、-20°Cで最大2年間保存できます。解凍後、ストックIL3は4°Cで15日間保存できます。
   7. ヒトマクロファージコロニー刺激因子(CSF1)ストック溶液(10 μg/mL)を調製するには、CSF1を0.2% BSA PBS溶液に溶解します。ストック溶液を1 mLアリコートとしてクライオチューブに分配します。ストック溶液は、-20°Cで最大2年間保存できます。解凍後、ストックCSF1は4°Cで15日間保存できます。
2. ステージ1:胚様体の生成(0日目〜3日目)
   1. 0日目に、2.25 mLのステージ1培地(hESC-SFMに50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF、および20 ng/mL SCFを添加)を超低アタッチメント6ウェルプレートの2つのウェルに加えます。
   2. 6ウェルプレート内のiPS細胞の80%コンフルエントウェル1個のメンテナンス培地を、1.5mLのステージ1培地と交換します。
   3. 細胞継代ツールを使用してコロニーを切断し、ピペットで切断したコロニーを超低アタッチメント6ウェルプレートの2つのウェルに移します(材料の表を参照)。
   4. 2日目に、0.5 mLのhESC-SFM培地を使用して、サイトカインを最終濃度50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF、および20 ng/mL SCFにします
      手記： IPSCコロニーはEBになります(図2A)。
3. ステージ2:懸濁液中の造血細胞の出現
   1. 4日目に、6ウェル組織培養プレートの4ウェルを0.1%w/vゼラチンでコーティングし、少なくとも10分間インキュベー
   トします。
   2. ゼラチンを除去し、ステージ2培地2.5 mL(X-VIVO15に100 ng/mL CSF1、25 ng/mL IL-3、2 mMグルタマックス、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および0.055 mM 2-メルカプトエタノールを添加)を加えます。
   3. 形成されたEBを50 mLの遠心分離チューブに集め、重力によってチューブの底に沈殿させます。メディアを慎重に吸引します。
   4. EBを2 mLのステージ2培地に再懸濁します。
   5. 10〜15 EB(15個以下)を、2.5 mLのステージ2培地を含むゼラチンコーティングウェルに移します。
   6. EBを37°Cおよび5%_CO2空気でインキュベートします。
   7. メッキEBのメディアは、3〜4日ごとに2〜3週間交換します。
   8. 2〜3週間後、EBは非接着性造血細胞を懸濁液に放出し始めます.
      手記：この浮遊細胞の放出期間はさまざまで、細胞株に依存します。この懸濁液中の細胞は、回収してマクロファージに成熟させることができます(ステージ3を参照)(図2A)。
4. ステージ3:末端マクロファージの成熟
   1. 浮遊造血細胞を採取し、EBプレート上に培地(ステージ2培地)を補充します。
   2. 浮遊細胞を200 x gで3分間遠心分離します。
   3. 浮遊細胞をステージ3培地(X-VIVO15に100 ng/mL CSF1、2 mMグルタマックス、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加)に再懸濁します。
   4. プレートに細胞を回収し、未処理のプラスチック製10 cm細菌学グレードプレート(10 mL)またはコーティングされていない6ウェル組織培養プレート(3 mL)に0.2 x 10⁶細胞/mLの密度で
   遠心しました。
   5. 細胞をステージ3培地に9〜11日間保持し、5日ごとに培地を交換します
      手記： ステージ3のステップ1.4.1〜1.4.5は3〜4日ごとに繰り返すことができ、浮遊細胞は元のEBプレートから最大3か月間回収できます。

結果

図1:成熟機能性マクロファージへのiPS細胞の分化の図解。Biorenderで描かれた図。

図2:マクロファージとiPSC-DMの数と形態に対するiPS細胞の分化。(A)(左から右へ)IPSCコロニー、胚様体(EB)、採取した浮遊細胞、成熟マクロファージから得られた明視野画像。スケールバー = 100 μm. (B) Kwik-diff キットで染色したマクロファージ細胞スピンの画像。スケールバー = 25 μm. (

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain (セルマスク ディープレッド原形質膜染色)	サーモフィッシャー	C10046	凍結保存培地
クライオスターCS10	シグマ	C2874
CTS CELLstart基質	インビトゲン	A1014201	幹細胞基質
ブタスキンゼラチン	シグマ	G9136
組換えヒトBMP4タンパク質	研究開発	314-BP-010
組換えヒトIL3	プレプロテック	0200/03/10
組換えヒトMCSF(キャリアフリー)100ug	バイオレジェンド	574806
組換えヒトVEGFタンパク質	研究開発	293-VE-010
SCF(C-Kitリガンド)組換えヒトタンパク質	サーモフィッシャー	PHC2111
StemPro hESC SFMの	サーモフィッシャー	A1000701
StemPro EZPassage使い捨て幹細胞継代ツール	サーモフィッシャー	23181010
超低アタッチメントプレート:細胞培養用マルチウェルプレート、6ウェル、Cell Star細胞忌避剤表面	グライナー	657970
2-メルカプトエタノール(50 mM)	インビトゲン	31350010
DPBS、カルシウム、マグネシウム(500ml)	サーモフィッシャー	14040091
GlutaMAX サプリメント	サーモフィッシャー	35050061