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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
すべての動物実験は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物管理・使用委員会によって承認され、NIHの実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施されました。
1. 実験マウスから腰椎DRGを採取
する
- 実験を開始する前に、密度勾配培地(Percollなど)の作業溶液を調製し、9容量の培地と1容量のCa++/Mg++フリー10x HBSSを混合します。氷の上に置いてください。
- マウスに2.5%アベルチンで麻酔をかけます。後足のピンチに対する反応の欠如により、動物が完全に麻酔をかけられていることを確認します。
注:6〜8週齢の雄と雌の両方のマウスを使用しました。
- マウスを経心的に灌流し、予め冷却した1x PBS10 mLを投与します。
- マウスを仰臥位にし、4本の足をテープで固定して、化学薬品のヒュームフードの内側に置きます。鉗子で胸郭の下の皮膚を持ち上げ、手術用ハサミで小さな切開を行い、肝臓と横隔膜を露出させます。
- ハサミを使用して横隔膜と胸郭を切断し続け、胸膜腔を開いて鼓動する心臓を露出させます。
- 虹彩はさみで右心房付属器をすばやく切断します。出血が認められたら、左心室の後端に30Gの針を挿入し、事前に冷却した1x PBSを10mLゆっくりと注入して動物を灌流します。
- 腹臥位に置いたマウスで背側椎弓切除術を行います.
手記：細胞培養を計画している場合は、切開前にマウスに70%エタノールをスプレーし、解剖には滅菌済みの手術器具を使用してください。
- サイズ11のメスを使用して、胸部から仙骨部まで縦方向に横方向に深く切開します。ハサミで皮膚を剥がし、背筋層を露出させます。
- Friedman-Pearson Rongeurを使用して、腰仙椎突起と両側横突起が露出するまで結合組織と筋肉を剥がします。
- Noyes Spring Scissorを使用して背側の脊柱を慎重に開き、次にFriedman-Pearson Rongeurに切り替えて椎骨を切除し、無傷の脊髄神経が付着した脊髄を露出させます。
- 同側および反対側の腰椎DRG(私たちの研究ではL4 / L5 DRG)を慎重に解剖し、それを1 mLの氷冷Ca++/Mg++フリーの1x HBSSにDounce組織ホモジナイザーに入れます。これで、組織はステップ2.
の準備が整いました
手記：可能であれば、DRGに付着している脊髄神経をトリミングします。
2. マウスの腰椎DRGから単一細胞を分離
します
- Dounceホモジナイザーで緩い乳棒でDRG組織を20〜25回均質化します。
- 滅菌済みの70 μmナイロンセルストレーナーを滅菌済みの50 mLコニカルチューブに入れます。セルストレーナーを氷冷した1x HBSSの800μLで濡らすと、フロースルーが円錐形のチューブに集められます。
- ホモジナイザーから均質化された組織懸濁液をピペットで回収し、湿った70μmナイロン細胞ストレーナーを通して50mLのコニカルチューブに入れます。
- ホモゲナイザーを氷冷した 1x HBSS 800 μL で 2 回すすぎ、セルストレーナーを使用して同じ 50 mL コニカルチューブにデカントして収率を高めます。
- 1.5 mLの平衡化氷冷等張密度勾配培地(ステップ1.1で調製)を滅菌済みの5 mLポリスチレンFACSチューブに加えます。
- 細胞ホモジネートを50mLのコニカルチューブ(ステップ2.4)からFACSチューブに移し、ピペッティングで上下させて密度勾配培地とよく混合します。さらに500μLの1x HBSSを加えて、上部をシールします。
- 細胞を800 x gで4°Cで20分間遠心分離してペレット
化します。
- FACSチューブの底にある細胞ペレットを乱さずに、培地中のミエリンを含む上清を慎重に吸引します。
- FACS分析のために、5%ウシ胎児血清(FBS)を含むPBSまたはFACSバッファーに細胞を再懸濁します
手記：1つのマウスのL4/L5 DRGから少なくとも50,000〜100,000個の細胞が期待されます。
- 機械的に単離されたDRG細胞(L4/L5)を5%ウシ胎児血清を含むPBS100 μLに再懸濁し、αマウスCX3CR1-APC抗体(1:2,000)と暗所4°Cで1時間インキュベー
トします。
- 細胞を5 mLのPBSで1回洗浄し、細胞を360 x gで4°Cで8分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、FCAS分析のために細胞ペレットを300 μLのPBSに再懸濁します。セルソーティングを計画している場合は、代わりにセルをFACSバッファに再懸濁します。