動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 外科的切除と組織調製の手順:
- 小腸(SI)の外科的切除
- CO2窒息または施設の動物倫理委員会によって承認された同等の方法を使用してマウスを安楽死させます。
- マウスを外科的切除のための専用領域に移します。裏側を下に置き、70%エタノールで腹部を消毒します。開腹術は、恥骨から胸郭までの正中線に沿って腹部の皮膚と腹膜を切開し、腹膜腔を開くことにより開腹術を行います。
手記：腹腔を貫通して腸組織を損傷しないように、皮膚の比較的小さな領域で最初の切開を行います。目的の解剖学的境界まで切除を続けます。
- 盲腸を同定し、これは小腸の遠位部を構成する回腸終末の検出に理想的な目印です。
手記： 盲腸は通常、マウスの腹部の左下にあります。
- 回盲腸接合部を特定し、このレベルでできるだけ遠位に切り込みを入れて、小腸を盲腸から分離します。次のステップでは、壊れやすいPPは触れると簡単に崩壊するため、腸壁との過度の物理的接触を避けてください。
ハ- サミを使用して腸間膜を切ることにより、幽門括約筋まで小腸全体をそっと取り除きます。幽門と十二指腸の間の接合部を特定し、このレベルで十二指腸を切り取ると、腹腔から小腸が完全に剥離します
注:(i)過伸展は腸壁の破裂を引き起こす可能性があるため、避けてください。 (ii)PPリンパ球に加えてLPリンパ球の分離が必要な場合は、腸間膜脂肪の完全な除去が必要です。ただし、PP分離の場合のみ、残りの腸間膜脂肪は、さらなる分離ステップ中にいくつかの利点を提供する可能性があります。したがって、保存する必要があります。
- 剥離した小腸を冷冷RPMI + 10%ウシ胎児血清(FBS)で満たされた6ウェルプレートに置き、すべての腸セグメントが冷媒体に沈むまで組織を手動で穏やかに攪拌します。次のステップ全体で組織を氷上に維持します。
- 所望の数のマウス小腸を解剖した後、採取した小腸からPP切除に進む。
- PPの外科的切除と単一細胞懸濁液の調製:
- 鉗子を使用して腸間膜脂肪をつかみ、腸間膜側をペーパータオルに向けて置くことにより、ペーパータオルで小腸を優しく移します。組織の脱水やべたつきを避けるために、冷たいRPMI + 10%FBSで腸全体を湿らせます.
手記： SIの腸間膜側の脂肪組織セグメントがペーパータオルにくっつき、抗腸間膜側を上に向けたままにするため、この段階では腸間膜脂肪の残留が役立ちます。
- 腸壁の抗腸間膜側に「カリフラワーのような」形で白い多葉凝集体として現れるPPを特定します。
手記：すべてのPPが切除されるまで、管腔内容物を洗い流すことは推奨されません。管腔の内容物を空にすると、PPが崩壊し、PPと腸壁との間の色のコントラストが妨げられる可能性があり、これはPPの視覚的な識別に非常に役立ちます。
- 無腸側のPPを特定した後、外科用湾曲端はさみをPPに置き(曲線は上を向く必要があります)、PPをその遠位および近位の境界から拘束します。
随意：指先でPPをハサミの刃に向かってやさしく押します。この操作により、周囲の非PP組織をより適切に排除できます。PPを周囲の腸組織を除いて穏やかに切除します.
注:(i)このステップは、T細胞が豊富なLPや腸上皮などの隣接する腸コンパートメントからの細胞汚染を最小限に抑えながら、最大のPP細胞収量を得るために重要です。(ii)C57BL/6マウスから切除した1つのSIから、5〜10個のPP(平均サイズ、マルチローブ)を収集できます。さらに小さなPP(マルチローブレーテッドではない)を目指すことで、このプロトコルを使用してマウスあたり最大12-13個のPPの収集が可能になります(C57BL/6)。
- 切除したPPを氷冷RPMI + 10%FBSで満たされた12ウェル組織培養プレートに移し、鉗子または湾曲した外科用ハサミを使用して氷上で維持します><。
注:(i)PPを切除した直後は、ペーパータオルで組織を優しくこすることで、PP表面の粘液および腸内容物を洗浄できます。このステップは、PPリンパ球の生存率を向上させるのに役立ちます。(ii)PPをプレートに移す代わりに、サンプルの総数によっては、分離したチューブに移すことも考えられます。
- オプション:PPの除去とその後のウェルプレートへの配置が完了したら、PPを含む組織培養プレートの写真を撮ることにより、さまざまな実験/マウスグループから収集されたPPの数とサイズを文書化できます。
- 25 mLのRPMI + 10% FBS(37°Cで予熱)を充填した50 mLコニカルチューブのセットを準備します。ハサミを使用して、1 mLピペットでPPを吸引できる距離から1,000 μLのチップの端を切り取ります。1 mLピペットでPPを吸引し、12ウェル組織培養プレートから調製した50 mLコニカルチューブに移します><。
手記：マウスサンプルごとに新しいチップを使用して、サンプル間の相互汚染を回避します。
- 蓋を固定し、チューブを37°Cのオービタルシェーカーに垂直に置き、125〜150rpmで10分間連続的に攪拌します。その間、新しい50mLチューブのセットを準備し、各チューブの上部に40μmのセルストレーナーを置き、それを介してシングルセル懸濁液を調製します
注:(i)攪拌ステップは、残りの腸内容物、粘液、および細胞の破片を除去し、除去しない場合、細胞の生存率とPPリンパ球の回復を低下させます。(ii)消化過程により細胞表面からのCXCR5発現が劇的に失われるため、PP組織にいかなる種類の消化酵素も適用しないでください。
- 撹拌後、PPを新しく調製した円錐形の50 mLチューブの上部に置いた40 μmセルストレーナーに移します。10 mLシリンジプランジャーの丸みを帯びた面を使用して、セルストレーナーを通じてPPを穏やかに破壊し、シングルセル懸濁液を生成します。ストレーナーを15〜20 mLの冷たいRPMI + 10%FBS.
ですすいでください。
注意: (i)ろ過する前に、PPを含むチューブを水平に振ってください。この短い振とうにより、PPのセルストレーナへの転写が容易になります。(ii)非リンパ性免疫細胞(単球、マクロファージ、DCなど)の単離には、70μmのセルストレーナーの使用を推奨します。
- シングルセル懸濁液を350〜400 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を慎重に廃棄し、細胞を10 x 106細胞/mLの濃度で再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。