ヒトバフィーコートからの末梢血単核細胞の単離

要約

出典: Mily, A., et al. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオでは、密度勾配遠心分離により、ヒトバフィーコートから単球とリンパ球を含む末梢血単核細胞(PBMC)を単離する方法を示します。単離されたPBMCは、さらなる分析に使用できます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. メディアの準備

>注:すべての試薬と消耗品の詳細については、資料表に記載されています。

1. RPMI 完全培地: RPMI 1640 に 1 mM ピルビン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPES、および 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) を添加します。Mtb感染に対処する場合は、細胞培養培地中の抗生物質を避けてください。
2. 無血清RPMI培地:RPMI 1640に1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、および10 mM HEPESを添加します。

2. バフィーコートからの末梢血単核細胞の単離

>注:クラスIIバイオセーフティキャビネット内で人間の血液(伝染性の可能性がある)を使用してすべての作業を実行してください。廃棄する前に、残留血液製剤を消毒剤で15分間不活化します。.この場合、血液は健康なボランティアから採取されました。このin vitroマクロファージ分化プロトコルは、10 x 10⁶個の単離PBMC/ドナー/ウェルを含むように設定されました。各ドナーから、1つのバフィーコートには、全血に由来する約50mLの濃縮白血球懸濁液が含まれており、通常は500〜800×10⁶個のPBMCを提供し、そこから約10%または50〜80×10⁶個の単球を取り出すことができる。

1. 50 mLチューブに調製した15 mLの密度勾配培地の上に15 mLのバフィーコート血液をロードします。.ピペットの先端をチューブの壁に傾けて、密度勾配層の上に血液をゆっくりと重ねます。
2. チューブを600 x gで室温(RT)で25分間回転させ、加速0、減速0で回転させます。
   手記： 遠心分離の前に蓋を慎重に閉め、遠心分離後にチューブホルダーに漏れる可能性がないか常に確認してください。
3. 滅菌パスツールピペットで上部の血漿層を除去し、その後、滅菌パスツールピペットを使用して単核細胞層を新しい50mLチューブに慎重に収集します。無血清のRPMI培地をPBMCペレットに添加して、最終容量50 mLを得ます。チューブを数回反転させて慎重に混合し、500 x gでRTで5分間遠心分離します。
4. 上清を慎重に捨て、チューブの底を指で裏返して細胞ペレットを再懸濁します。
5. PBMCから密度勾配培地の汚染を除去するには、無血清RPMIで細胞を2〜3回洗浄し、最終容量50 mLを得ます。500 x gでRTで5分間遠心分離し、細胞上清が透明になるまで洗浄します。
6. 上清を捨て、細胞を20 mLの無血清RPMI培地に再懸濁します。
7. トリパンブルー染色、血球計算盤を使用した手動、または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液をトリパンブルーで1:2または1:10希釈し、細胞トリパンブルーサンプルを96ウェルプレート(例えば、50 μL + 50 μL(血球計算盤カウント用)または10 μL + 10 μL(自動細胞カウント用))で混合し、細胞をカウントして生細胞数/mL
   注意：トリパンブルーは有毒であり、別の化学廃棄物として廃棄する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リンポプレップ	アレレテクノロジーズAS	11508545
RPMIの1640	ライフテクノロジーズ株式会社	01 SH30096
EDTA(0.5メートル)	カロリンスカ大学病院、ハッディンゲ	該当なし
Na-ピルビン酸	GEヘルスケアライフサイエンス	01 SH300239月
L-グルタミン	GEヘルスケアライフサイエンス	01 SH30034月
ヘープス	GEヘルスケアライフサイエンス	01 SH30237月
ウシ胎児血清(FBS)	シグマ・アルドリッチ	F7524