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人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. 単球由来細胞の分化と分極
- 単球の単離にはプラスチック接着剤を使用してください。簡単に説明すると、6ウェル培養プレートに新たに単離した末梢血単核細胞(PBMC)を適切な濃度、例えば10 x 106 PBMC/ウェルの2 mL無血清RPMI培地(RPMI 1640に1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPESを添加)で播種し、37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
- 2〜3時間後、非接着性細胞をピペットで除去し、ウェルを1 mLの無血清培地で3回洗浄します。付着細胞は単球であり、ウェルに添加された全PBMCの約10%、すなわち、ウェルごとに添加された10×106個のPBMCから回収された10個の6個の単球を含む。
- マクロファージの分化には、マクロファージの分極にそれぞれ50 ng/mL GM-CSFまたはM-CSFを含有するワーキング溶液を調製し、ウェルあたり2 mLのRPMI完全培地に添加します。5% CO2インキュベーターで細胞を37°Cで3日間培養します。
- 3日目に、各ウェルの最上層から1 mLの細胞培養培地を慎重に取り出し、2倍の濃度のM-CSFまたはGM-CSFを含む新鮮なRPMI完全培地1 mLを細胞培養液に添加して、ウェル内の最終濃度を50 ng/mLにします。成長因子を100 ng/mL/ウェルの既製の作業溶液に加えます。
- 6日目に、細胞分化の最後の18〜20時間に異なる刺激を加えて、完全に分極した成熟したM1(インターフェロンγ;IFN-γ、およびリポ多糖類。LPS(大腸菌O55:B5))またはM2(インターロイキン4;IL-4)マクロファージ。M1分極のためには、RPMI完全培地(1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPES、および10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)をRPMI 1640に添加)でIFN-γおよびLPSを調製し、ウェルあたり50 μLを添加して、細胞培養物の最終濃度50 ng/mL IFN-γおよび10 ng/mL LPSを得ます。M2分極のためには、RPMI完全培地でIL-4を調製し、ウェルあたり50 μLを添加して、細胞培養物中の最終濃度20 ng/mLを得ます。
- M0分極マクロファージの分化には、サイトカインを追加せずに、M-CSFのみで細胞を刺激します(M2様表現型を提供します)。
- 単球由来細胞培養の形態を光学顕微鏡で定期的にチェックし、小さな単球がより大きなマクロファージ様細胞に分化していることを確認します。また、M1分極とM2分極の間の潜在的な形態学的違い、すなわち、より丸みを帯びた形状のM2細胞と比較した細長いM1細胞と伸びたM1細胞
を監視します。