方法論記事

一般的なリンパ系前駆細胞からの形質細胞様樹状細胞のin vitro作製

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2025年7月8日

この記事について

要約

出典:Chang, S., et al.AC-6フィーダーシステムを使用した一般的なリンパ系前駆細胞からのマウス形質細胞様樹状細胞のin vitro作製。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、一般的なリンパ系前駆細胞(CLP)から形質細胞様樹状細胞(pDC)を生成するin vitroアッセイを示しています。Fms様チロシンキナーゼ-3リガンド(FL)の存在下で、精製されたCLPをγ照射したフィーダー細胞と共培養すると、CLPは非接着性pDCに分化し、その存在はフローサイトメトリーを用いて確認されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. AC-6フィーダーセルの調製

>注:AC-6.21(略してAC-6)間質細胞株(スタンフォード大学のI.ワイスマンから提供)は、15%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMIで維持する必要があります。フィーダー細胞として機能するために、AC-6細胞は共培養の1日前に3,000 rad(30Gy)をγ照射し、増殖を防ぎます。なお、AC-6細胞は、メンテナンス時に過密状態が放置されたり、通過回数が20を超えると分化支援能力が失われやすくなります。

  1. AC-6細胞を1 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1回洗浄し、吸引してDPBSを除去します。AC-6細胞を0.8mlのトリプシン溶液(0.05%トリプシンと0.5mM EDTAのDPBSで)で3〜5分間37°C、5%CO2で処理し、その後、10容量の培養培地で希釈して反応を停止し、単一細胞懸濁液を作ります。
  2. AC-6細胞を5.9x104細胞/ウェルで12ウェルプレートに播種し、37°C、5%CO2 O/N.
    でインキュベートします 手記： AC-6セルの密度は、密度が低いほどcDCの生成に有利に働くため、非常に重要です。5.9x104細胞/ウェルの密度で播種すると、AC-6は翌日までにコンフルエントに達することができ、これはCLPからのpDCの誘導に最適です。
  3. AC-6細胞にγ照射器を用いて3,000rad(30Gy)で照射します.
    注:AC-6の照射に使用される線量は、細胞の増殖を防ぎながら、DCとCLPの分化に必要なサイトカインと細胞間接触を提供するのに十分な期間、細胞の生存状態を保つために最適化されています。
  4. 培地を吸引し、1 mLの完全RPMI(10%熱不活化FBS、50 μg/mlゲンタマイシン、50 μM β-メルカプトエタノールを含むRPMI)と交換します。

2. マウスからBM細胞を単離する

  1. CO2窒息と頸部脱臼によるマウスの犠牲。マウスを解剖トレイに置き、70%エタノールで滅菌します。腹部中央部を切開し、マウスの遠位部から皮膚を切除し、下肢を覆う皮膚を含めます。
  2. 半滅菌フードでマウスを解剖します。大腿骨と脛骨を解放するには、大腿骨を上にクリップし、脛骨を膝関節の下にクリップします。ハサミを使用して骨から筋肉を切り離し、5mlの完全なRPMIを含む6cmのシャーレに骨を置きます。
  3. 無菌培養フードに移動します。27Gの針に接続された3mlのシリンジに完全なRPMIを充填します。ハサミで骨の両端を切り取り、27Gの針を挿入して骨髄を洗い流し、両端から1回ずつ完全なRPMIを静かに注入します。
  4. 針のないシリンジを使用して、培養皿内で細胞を3〜5回静かにピペッティングして、単一細胞懸濁液を調製します。
  5. 細胞を500 x gで5分間遠心分離し、上清をデカントします。
  6. 1 mLのACKバッファー(150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA)で赤血球を溶解し、1分間インキュベートし、10容量の完全RPMIで希釈して反応を停止します。重力によって死んだ細胞の塊や組織の破片をペレット化するために、細胞を5分間放置します.
    手記：生細胞の沈降により細胞が失われるため、5分以上放置しないでください。
  7. 細胞を含む上清を新しいチューブにゆっくりとデカントし、元のチューブに破片を残します。
  8. 500 x gで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去して廃棄します。
  9. 総BM細胞(通常、1匹のマウスから4-6×107個のBM細胞が得られる)を100μlのFACSバッファー(1x PBS+ 2% FBS+ 1mM EDTA)に再懸濁します。

3. CLPのFACS分析と選別

  1. Fc受容体をブロックするために、抗CD16/32(ハイブリドーマスーパーナントクローン2.4G2、50μl/反応または1-2μg/反応)をFACSバッファー内の細胞に1〜2分間添加します
    手記：抗CD16/32はFcブロックとも呼ばれ、顆粒球、単球、Bリンパ球などのFc受容体を発現する細胞への抗体の非特異的結合を防ぐために添加されます。
  2. 以下の蛍光色素標識抗体(4x107細胞用)で細胞を氷上で15分間同時に染色し、周囲光を避けます。抗体:抗CD3(17A2)、抗CD8(53-6.7)、抗B220(RA3-6B2)、抗CD19(eBio1D3)、抗CD11b(M1/70)、抗Gr-1(RB6-8C5)、抗Thy1.1(HIS51)、抗NK1.1(PK136)、抗TER119(TER-119)、および抗MHC-II(NIMR-4)、0.2μgの抗C-Kit-PerCP-Cy5.5(2B8)、1μgの抗Sca-1-FITC(D7)、0.4μgの抗M-CSFR-APC(AFS98)、および0.2μgの抗IL-7Rα-PE-Cy7(A7R34)。
  3. 細胞を3 mLのFACSバッファーで洗浄し、500 x gで5分間遠心分離します。
  4. 細胞を300 μLのFACSバッファーに再懸濁し、40 μMの細胞ストレーナで細胞をろ過します。
  5. 追加の100 μLのFACSバッファーでチューブを洗浄し、残っている細胞を回収し、同じ細胞ストレーナーを使用して滅菌FACSソーティングチューブにろ過します。
  6. 染色後すぐに、シグナル検出に適したフィルターと電圧を使用してフローサイトメトリー解析を実施します。488 nm レーザーを使用して FITC、PerCP-Cy5.5 標識抗体を検出し、561 nm レーザーで PE および PE-Cy7 標識抗体を検出し、633 nm レーザーで APC 標識抗体を検出します。
  7. セルソーターを使用して、次のマーカーに従ってCLPを選別します:lin-c-kit intSca-1intM-CSFR-IL-7Rα+(ステップ3.2で染色)。選別した細胞を、8 mLの完全RPMIが入った15 mLのチューブにクッションとして集めます。
  8. 実行の終了時にセルソーターによって示されるように、ソートされたセルの絶対数を記録します。通常、5x104 CLPは1つのマウスのBMから取得できます。

4. コカルチャー CLP と AC-6

  1. ステップ3.7から選別した細胞を500 x gで10分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを十分な完全RPMIで再懸濁して、約5x104細胞/mlの細胞密度を得る。 ステップ1.4で調製したフィーダー細胞を含む12ウェルプレートに500細胞/ウェルをシードします。
  2. 100 ng/ml FL(hu-Flt3L-Ig は、スイスのチューリッヒ大学病院の M. Manz 提供の発現系を使用して社内で作製)を加え、37°C、5% CO2 でインキュベートし、顕微鏡下で DC 発生を定期的に目視モニタリングします
    手記：市販の組換えヒトFLまたはマウスFLをhu-Flt3L-Igの代替として使用して、DC開発をサポートすることができます。
  3. 12日目に上清中の細胞を収集し、得られた上清を組み合わせた0.5 mLの完全RPMI培地でウェルを1回洗浄します。0.5 mLの新鮮な培地を加え、接着細胞をセルスクレーパーでスクラップします。
  4. 両方の部品から得られた細胞含有培地を混合し、500 x gで5分間遠心分離します。
  5. 上清をデカントし、細胞を50 μlのFACSバッファーに再懸濁します。50 μlの抗CD16/32ハイブリドーマ上清を添加し、1〜2分間インキュベートしてFc受容体をブロックします。
  6. すべての細胞を、抗CD11c-APC(N418)、抗CD11b-FITC、および抗B220-PEの各抗体(各0.05μg)で列挙し、染色します。
  7. ステップ3.3で説明したように細胞を洗浄し、遠心分離します。
  8. 細胞を100 μl FACSバッファーに再懸濁し、CD11c+にゲートし、cDC(CD11c+CD11b+B220-)およびpDC(CD11c+CD11b-B220+)を分析します。

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗マウスLy6g/Ly6c(PE)、クローンRB6-8C5バイオレジェンド108408リネージマーカー
抗マウスNK1.1(PE)、クローンPK136バイオレジェンド108708リネージマーカー
抗マウスCD11b(PE)、クローンM1/70バイオレジェンド101208リネージマーカー
抗マウスCD19(PE)、クローンeBio1D3バイオレジェンド115508リネージマーカー
抗マウスB220(PE)、クローンRA3-6B2バイオレジェンド103208リネージマーカー/FACS
抗マウスCD3(PE)、クローン17A2バイオレジェンド100308リネージマーカー
抗マウスCD8a(PE)、クローン53-6.7バイオレジェンド100707リネージマーカー
抗マウスMHC-II(PE)、クローンNIMR-4バイオレジェンド107608リネージマーカー
抗マウスTer119(PE)、クローンTER-119バイオレジェンド116208リネージマーカー
抗マウスThy1.1(PE)、クローンHIS51eバイオサイエンス12-0900-83リネージマーカー
抗マウスM-CSFR(APC)、クローンAFS98バイオレジェンド135510FACSの
抗マウスc-Kit(PerCP/Cy5.5)、クローン2B8バイオレジェンド105824FACSの
抗マウスSca-1(FITC)、クローンD7バイオレジェンド108106FACSの
抗マウスIL-7Ra(PE/Cy7)、クローンA7R34バイオレジェンド135014FACSの
抗マウスCD11c(PerCP/Cy5.5)、クローンN418バイオレジェンド117328FACSの
抗マウスCD11b(FITC)、クローンM1/70バイオレジェンド101206FACSの
FACSアリアIIIBDバイオサイエンスセルソーター
FACS選別チューブBDバイオサイエンス352054
フロージョFlowJo LLCフロー解析ソフトウェア
の

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タグ

FLT3

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