単球からの未熟、成熟、および寛容性樹状細胞の作製

要約

出典:Sim, W. J. et al., 異なる代謝表現型を持つ未熟、成熟、および寛容性樹状細胞の生成。J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオは、ヒト単球からの未熟、成熟、および寛容性の樹状細胞(DC)の生成を示しています。単球を成長因子やサイトカインとインキュベートすると、未成熟なDCが産生されます。免疫調節分子に応答して、未成熟DCは寛容性DCと成熟DCに分化します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 末梢血単核細胞(PBMC)の単離

1. 試薬の調製
   1. PBS/EDTAを調製する:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製し、2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を補充します。この溶液を0.2μmフィルターでろ過して滅菌します。PBS / EDTAを4°Cで保存し、室温まで温めてから使用してください。
   2. 染色緩衝液の調製:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と2%ウシ胎児血清(FBS)、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、および2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を補給します。この溶液を0.2μmフィルターでろ過して滅菌します。
2. ブラッドコーンから血液を収集
   手記：血液コーンには、病院からの血小板フェレーシス後に収集された白血球成分が含まれています。血液をヘパリンまたはEDTAチューブに採取する場合は、血液をPBSで1:1の比率で希釈し、手順1.3に進みます。バフィーコートを受け取った場合は、バフィーコートをPBSで1:2の比率で希釈し、手順1.3に進みます。
   1. コーンの両端をカットして、血液が50mlのチューブに流れ出るようにします><。 コーンには通常10mlの血液が含まれていることに注意してください。
   2. 30 mlのPBS / EDTAを含む鈍い端のシリンジを使用してコーンを洗浄し、50 mlのチューブに集めます。.
   3. PBS / EDTAで血液をさらに希釈して、最終容量を80 mlにします。.
3. 密度遠心分離によるPBMCの単離
   1. 15 mlのFicollをそれぞれ4本の新鮮な50 mlチューブに分注します。
   2. 25 mlの血清ピペットを使用して、希釈した血液20 mlをFicoll層に加えます。.50 mlチューブを45の角度で保持し、間相を乱さないように注意してください。.
   3. チューブをブレーキなしで805 x gで30分間、20°Cで遠心分離します。
   4. プラズマ層を取り外し、プラズマ層のすぐ下にあるPBMCのリングをパスツールピペットで収集します。PBMCの4本のチューブを2本の50mlチューブに組み合わせます。PBMCの下の透明層を収集しないように注意してください。
   5. PBMCのチューブあたり50 mLの最終容量にPBS/EDTAを添加し、ブレーキ付きで548 x gで10分間、20°Cで遠心分離します。
   6. 上清を吸引し、各チューブ内のペレットを25 mLの染色バッファーで再懸濁し、1本の50 mLチューブに結合します。
   7. 367 x gでブレーキ付きで5分間、4°Cで遠心分離します。
   8. 上清を吸引し、ペレットを10 mLの染色緩衝液で再懸濁します。

2. 磁気分離による単球濃縮

1. セル番号の決定
   1. PBMC細胞懸濁液20 μlをトリパンブルー20 μlと混合し、サイトメーターを使用して生細胞の数をカウントします。
   2. セル懸濁液を367 x gで遠心分離し、ブレーキをかけて4°Cで10分間保存します。
   3. 上清を完全に吸引し、細胞ペレットを染色バッファー80μlあたり10⁷細胞の濃度に再懸濁します。
2. 磁気ラベリング
   1. 10⁷細胞あたり20 μlのCD14マイクロビーズを加え、よく混合し、2 - 8 °Cで15分間インキュベー
   トします。
   2. 10⁷細胞あたり1 mLの染色緩衝液を加えて細胞を洗浄し、ブレーキ付き367 x gで10分間、4°C遠心分離します。
   3. 上清を完全に吸引し、染色バッファー50μlあたり10⁷細胞の濃度で細胞ペレットを再懸濁します。
3. 磁気分離
   1. 最大2 x 10 8個の合計セルに対して中サイズの列を使用します。
      手記：データシートで推奨されている総セル数とCD14⁺セル数に応じて、適切なカラムとセパレータを選択してください。
   2. カラムを適切なセパレーターの磁場に置き、500 μlの染色バッファーですすいでカラムを調製します。
   3. 細胞懸濁液をカラムにピペットで移し、カラムを通過する非標識細胞を15 mLチューブで回収します。
   4. 新しい15 mLチューブをカラムの下に交換し、500 μlの染色バッファーでカラムを3回洗浄します。洗浄の合間に新しい染色バッファーを追加する前に、カラムリザーバーが空であることを確認してください。
   5. カラムをセパレーターから取り外し、新しい15 mLチューブの上に置きます。
   6. 1 mLの染色バッファーをカラムにピペットで移します。プランジャー(キットに付属)をカラムにしっかりと押し込んで、磁気標識されたセルをすぐに洗い流します。
   7. 新しいカラムで溶出した画分を使用してステップ2.3.2から2.3.6を繰り返し、CD14+細胞の純度を上げます。ビーズは、ステップ3.2で培養中に自動的に細胞から放出されることに注意してください。

3. 樹状細胞の異なる活性化状態への分化

1. 試薬の調製(エンドトキシンレベルはすべての試薬で0.1 EU / ml未満である必要があります)
   1. 細胞培養培地の調製:RPMI 1640に10%ウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、および0.05 mM 2-メルカプトエタノール(2ME)を添加。この溶液を0.2μmフィルターでろ過して滅菌します。
   2. サイトカインの調製:無菌条件下で、IL-4およびGM-CSFを細胞培養グレードの水でそれぞれ0.25 mg/mlの濃度に再構成します。サイトカインを200 μLの微量遠心チューブに分注し、-80°Cで保存します。
   3. ビタミンD3ストックの調製:無菌条件下で、細胞培養グレードの水にビタミンD3を100 mMの濃度に再構成します。ビタミンD3を1.5 mLの微量遠心チューブに分注し、-20°Cで保存します。
   4. デキサメタゾンストックの調製:デキサメタゾンを細胞培養グレードの水に無菌条件下で10 mMの濃度に再構成します。デキサメタゾンを1.5 mLの微量遠心チューブに分注し、-20°Cで保存します。
   5. LPSの調製:無菌条件下で、細胞培養グレードの水でリポ多糖(LPS)を1 mg / mlの濃度に再構成します。LPSを1.5 mLの微量遠心チューブに分注し、-20°Cで保存します。
2. 異なる moDC の生成
   1. 0.3 - 0.5 x 10⁶/ml の濃度の CD14⁺ 単球 4 セットに、200 ng/ml の GM-CSF と 200 ng/ml の IL-4 を 6 ウェルプレートで添加します。これは0日目であり、各6ウェルの培地の容量は2 mLであることに注意してください。
   2. 組織培養インキュベーターで細胞を37°C、5% CO₂でインキュベー
   トします。
   3. 4日目に培地850 μlを培養液から取り出し、300 x gで5分間、4 °Cで遠心分離します。上清を吸引し、2x (200 ng/ml のGM-CSFおよび200 ng/ml のIL-4)を含む細胞培養培地1 mLにペレットを再懸濁します。この細胞混合物を培養物に戻します。GM-CSFおよびIL-4に添加した2倍の濃度は、1 mLの培地を培養物に戻すと1倍になることに注意してください。
   4. 5日目に、培地1 mLあたり1 μlのビタミンD3ストックと1μlのデキサメタゾンストックを2セットに加えて、寛容性moDCを生成します。ビタミンD3の最終濃度は100 nM、デキサメタゾンは10 nMであることに注意してください。GM-CSFとIL-4の添加は5日目には必要ありません。
   5. 6日目に、200 ng/mlのGM-CSFと200 ng/mlのIL-4をすべてのセットに加えます。
   6. 6日目にGM-CSFとIL-4のみで処理したセットの1つに1μg/mlのLPSを添加して、成熟したmoDCを生成します。
   7. 6日目に1セットのLPSを寛容原性moDCに加えて、LPS寛容性moDCを生成します。
   8. 7日目に、フローサイトメトリーまたはその他の研究のために培養皿をPBS、EDTAで洗い流すことにより、さまざまな種類のmoDCを回収します。非接着性細胞のみが採取されることに注意してください。未成熟moDC、成熟moDC、寛容性moDC、およびLPS寛容性DCのCD14⁺単球からの収量の割合は、それぞれ約90%、50%、60%、および60%であり、献血者とFBSロットの間で異なることに注意してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フィコール	GEヘルスケア	17-1440-03	PBMCアイソレーション
注射器	ベクトン、ディキンソン	302832	PBMCアイソレーション
1.5 mL遠心チューブ	アクシゲン	MCT-150-Cシリーズ	PBMCアイソレーション
15 mLファルコンチューブ	隼	352096	PBMCアイソレーション
50 mLファルコンチューブ	隼	352070	PBMCアイソレーション
遠心機	エッペンドルフ	5810R型	PBMCアイソレーション
0.2μmフィルター	ザルトリウス・ステディム・バイオテクノロジー	17597	PBMCアイソレーション
MACキット	ミルテニーバイオテック	〒130-042-201	単球濃縮
MiniMACSセパレーター	ミルテニーバイオテック	〒130-042-102	単球濃縮
細胞培養グレードの水	Invitrogen, ライフテクノロジーズ		細胞培養
RPMI(ルプミ)	ギブコ、ライフテクノロジーズ	11875-093	細胞培養
FBSの	ハイクロン	SH30070103	細胞培養
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ、ライフテクノロジーズ	15140	細胞培養
リン酸緩衝生理食塩水	ギブコ、ライフテクノロジーズ	10010-031	細胞培養
NEAAの	ギブコ、ライフテクノロジーズ	11140-040	細胞培養
EDTAの	ギブコ、ライフテクノロジーズ	15575	細胞培養
ヘープス	ギブコ、ライフテクノロジーズ	15630から080	細胞培養
ピルビン酸ナトリウム	ギブコ、ライフテクノロジーズ	11360-070	細胞培養
GM-CSFの	ミルテニーバイオテック	〒130-093-868	細胞培養
IL-4	ミルテニーバイオテック	〒130-093-924	細胞培養
ビタミンD3	シグマ	D1530	細胞培養
デキサメタゾン	シグマ	D2915	細胞培養
組合	シグマ	L2755	細胞培養
トリパンブルー	ギブコ、ライフテクノロジーズ	15250-061	細胞培養

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