ヒト末梢血からのB細胞の単離と精製

要約

出典: Tzeng, S. J. 血液からのヒト抗体分泌B細胞の単離、分化、定量化:体液性免疫の機能的読み出しとしてのELISpot。 (2016年)

このビデオでは、非B細胞に特異的なビオチン化抗体とストレプトアビジン結合磁気マイクロビーズを使用して、ヒト末梢血からB細胞を単離する様子を実演しています。

プロトコル

人間の参加者が関与するすべての手続きは、人間の福祉に関する制度的、国内的、および国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査

されています

1. ヒト末梢血B細胞の単離と精製

1. 正中肘静脈(肘より前の肘窩内)からK₂EDTA(1.5〜2.0 mg/mLの血液)が入った15 mLチューブに~10 mLの血液を採取し、すぐにチューブを数回反転させて血栓の形成を防ぎます。
2. 35 mLのオートクレーブ処理(121 °C、15 分)赤血球(RBC)溶解バッファー(150 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、1 mM EDTA、pH 7.4)を新鮮血液サンプル(≥ 3:1 vol/vol)が入ったチューブに加え、室温(RT)で5分以内にインキュベートします< br /> 手記： チューブを通る光透過の出現は、RBC溶解の完了を示しています。
3. 600 x gでRTで5分間遠心分離し、ペレットの色が白であることを確認します。
4. 10 mLのオートクレーブ処理リン酸緩衝生理食塩水(PBS、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄、および1.47 mM KH₂PO₄、pH 7.4)でペレットを再懸濁し、ステップ1.3と同様に遠心分離します。
5. 上清を捨て、ペレットを10 mLのRPMI 1640培地(サプリメント:10%ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、0.25 μg/mLアムホテリシンB、および2 mM L-グルタミン)で再懸濁し、細胞を10 cm培養皿(皿あたり10 mLの血液)に播種します。ディッシュを5% CO₂を入れた37°Cのインキュベーターに30分間置きます。
6. 培養皿を数回静かに回転させ、培養培地(浮遊細胞)を15mLのプラスチック製円錐管に入れます。培養皿に付着した細胞(主にマクロファージ)を廃棄します。
7. 室温で600 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
8. ペレットを1 mLのRPMI 1640培地で再懸濁します。血球計算盤または自動セルカウンターで細胞数をカウントします.
   手記： 単離された白血球の生存率は、通常、トリパンブルーの排除によって90%を超えます。
9. ステップ 1.7 と同様に遠心分離し、細胞を ~ 200 μL の冷たく PBS バッファー (0.5% ウシ血清アルブミン (BSA) および 2 mM EDTA) に 5 - 10 x 10⁶ 細胞/mL の濃度で再懸濁します。
10. 10⁶細胞あたり5 μLの血液細胞特異的ビオチン化抗ヒトAbカクテル(B細胞のネガティブセレクション用)を加え、氷上で30分間インキュベートします
    手記： 反ヒトAbカクテルには、少なくともCD2(またはCD3)、CD14、およびCD16に特異的なAbsを含める必要があります。
11. 10倍の余剰量の滅菌PBSを細胞に加え、600 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
12. 等量のストレプトアビジン結合マイクロビーズ(10⁶細胞あたり5 μL)をペレットに加え、十分に混合します。
13. 15 mLのプラスチック製円錐チューブで氷上で30分間インキュベートします。
14. 2 mLのPBSバッファーをチューブに加えます。
15. チューブを磁気スタンドに入れ、室温で8分間インキュベートします。茶色のマイクロビーズは、磁石の隣のチューブ壁に徐々に付着します。
16. チューブを磁気スタンドに残した状態で、上清を新しい滅菌15mLチューブに慎重に移します。
17. 手順1.14から1.16を繰り返し、手つかずのB細胞を含む2つの上清を結合します。マイクロビーズを捨てます。
18. 室温で600 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
19. ペレットをRPMI 1640培地に再懸濁して、下流の実験に用いてください
    手記： 典型的には、10mLの末梢血から95%を超える純度の1〜5×10⁵ B細胞を単離することができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BDバキュテイナーK2E	BDバイオサイエンス	367525	10mlチューブ
フィコール・パケ・プラス	GEヘルスケア	17-1440-02	エンドトキシンフリー
トリパンブルー0.5%溶液	バイオ産業	03-102-1B	染める
IMag Human B lymphocyte enrichment set (ヒト B リンパ球濃縮セット	BDバイオサイエンス	558007	試薬
ストレプトアビジン磁気マイクロビーズ	BDバイオサイエンス	9000810	試薬
15mlファルコンチューブ	BDファルコン	352196	プラスチック製品
ビオチン化 CD27 mAb	バイオレジェンド	302804	クローンO323
ビオチン化抗ヒトCD27	バイオレジェンド	302804	クローンO323
ビオチン化抗ヒトCD27	eバイオサイエンス	13-0279-80	クローンO323

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