フローサイトメトリーを用いた、さまざまな循環型B細胞集団の細胞ソーティング

Abstract

出典:Tzeng, S. J. 血液からのヒト抗体分泌B細胞の単離、分化、定量化:体液性免疫の機能的読み出しとしてのELISpot。

このビデオでは、ヒト末梢血B細胞からのナイーブB細胞、メモリーB細胞、および形質芽細胞形質細胞亜集団のフローサイトメトリーベースの選別のためのプロトコルについて説明します。B細胞表面に発現するCD19、CD27、およびCD38受容体に結合するフルオロフォアベースの抗体と、それに続く細胞ソーティングに基づいて、異なるB細胞亜集団を区別することができます。

Protocol

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. ナイーブB細胞、メモリーB細胞、形質芽細胞/形質細胞(PB/PC)の細胞選別

1. 精製したヒト末梢血B細胞を用いて、血球計算盤または自動セルカウンターを用いて細胞数を決定します。
2. 細胞を5mLポリスチレンチューブ内の1mLあたり10.7の濃度で冷たいPBS緩衝液に再懸濁します。
3. 10⁶細胞あたり1〜2 μgのヒトIgGを添加し、Fcブロックについて氷上で10分間インキュベー
トします。
4. 抗CD19-APC(クローン:HIB19)、抗CD27-eFluor450(クローン:O323)、および抗CD38-PE(クローン:HIT2)を6細胞10個につき各1μg加え、よく混合し、氷上で30分間インキュベー
トする。
5. ステップ1.4の最後の5分間に、市販の7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)を5 μL加えます。
6. 2 mLのPBSをチューブに加え、ボルテックスで600 x gで5分間遠心分離します。
7. 15 mLチューブ内で、1 mLあたり1 - 5 x 10⁷細胞の濃度でソーティングバッファー(2% BSAおよび2 mM EDTAを含む滅菌PBS)に細胞を再懸濁します。
8. ナイロンメッシュのセルストレーナー(孔径40μm)で細胞をろ過し、細胞の凝集体を排除します。
9. バイオレット(405 nm)、ブルー(488 nm)、レッド(640 nm)の3つのレーザーを搭載したフローサイトメトリーソーターで細胞を分離します
   注:青色レーザーだけで3色フローサイトメトリーに十分です。
10. 細胞を3本の15 mLチューブ(5 mLのRPMI培地を含む)に選別し、ナイーブB細胞(CD19⁺CD27^-)、メモリーB細胞(CD19⁺CD27+/hi CD38+)、PB/PC(CD19⁺CD27^+/hiCD38⁺)を同時に収集します
    手記：選別されたナイーブB細胞とメモリーB細胞は、さらに培養することができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL ファルコンチューブ	BDファルコン	352196
ブルーナイロンメッシュセルストレーナー、40 μm	BDファルコン	352340
反ヒトCD19-APC	バイオレジェンド	302212	クローンHIB19
抗ヒトCD27-eFluor 450	eバイオサイエンス	〒48-0279-42	クローンO323
反ヒトCD38-PE-Cy7	バイオレジェンド	303516	クローンHIT2
反ヒトCD38-PE-Cy7	BDバイオサイエンス	560677	クローンHIT2
反ヒトCD45-FITC	バイオレジェンド	304006	クローンHI30
反ヒトCD45-FITC	BDバイオサイエンス	555482	クローンHI30
抗マウス/ラット/ヒトCD27-PerCP Cy5.5	バイオレジェンド	124213	クローンLG.3A10
抗ヒトCD27-PerCP Cy5.5	BDバイオサイエンス	65429	クローンL128
反ヒトCD19-FITC	ミルテニーバイオテック	〒130-098-064	クローンLT19
反ヒトCD19-FITC	ジェネテックス	GTX75599	クローンLT19
反ヒトCD20-FITC	BDバイオサイエンス	555622	クローン 2H7
7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)	BDバイオサイエンス	559925
ヒトIgG	ジャクソン免疫研究	009-000-003