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人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
ヒトの末梢血は、インフォームドコンセントの下で健康なドナーから採取されなければならず、血液サンプルの使用は、審査委員会によって確立された承認されたガイドラインに準拠しなければなりません。この研究では、フローサイトメトリー(図1)およびELISpotアッセイ(図2)の結果のデモンストレーションでヒト血液を使用するプロトコル。
1. ヒト末梢血B細胞の単離と精製
- 正中肘静脈(肘より前の肘窩内)からK2EDTA(1.5〜2.0 mg/mLの血液)が入った15 mLチューブに~10 mLの血液を採取し、すぐにチューブを数回反転させて血栓の形成を防ぎます。
- オートクレーブ処理(121°C、15分)した赤血球(RBC)溶解バッファー(150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、および1 mM EDTA、pH 7.4)35 mLを新鮮血液サンプル(≥ 3:1 vol/vol)が入ったチューブに加え、室温(RT)で5分以内にインキュベートします
手記：チューブを通る光透過の出現は、RBC溶解の完了を示しています。
- 600 x gでRTで5分間遠心分離し、ペレットの色が白であることを確認します。
- 10 mLのオートクレーブ処理リン酸緩衝生理食塩水(PBS、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4、および1.47 mM KH2PO4、pH 7.4)でペレットを再懸濁し、ステップ1.3と同様に遠心分離します。
- 上清を捨て、ペレットを10 mLのRPMI 1640培地(サプリメント:10%ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、0.25 μg/mLアムホテリシンB、および2 mM L-グルタミン)で再懸濁し、細胞を10 cm培養皿(皿あたり10 mLの血液)に播種します。ディッシュを5% CO2を入れた37°Cのインキュベーターに30分間置きます。
- 培養皿を数回静かに回転させ、培養培地(浮遊細胞)を15mLのプラスチック製円錐管に入れます。培養皿に付着した細胞(主にマクロファージ)を廃棄します。
- 室温で600 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- ペレットを1 mLのRPMI 1640培地で再懸濁します。血球計算盤または自動セルカウンターで細胞数をカウントします。
手記：単離された白血球の生存率は、通常、トリパンブルーの排除によって90%を超えます。
- ステップ 1.7 と同様に遠心分離し、細胞を ~ 200 μL の冷たく PBS バッファー (0.5% ウシ血清アルブミン (BSA) および 2 mM EDTA) に 5 - 10 x 106 細胞/mL の濃度で再懸濁します。
- 106細胞あたり5 μLの血液細胞特異的ビオチン化抗ヒトAbカクテル(B細胞のネガティブセレクション用)を加え、氷上で30分間インキュベートします
手記：反ヒトAbカクテルには、少なくともCD2(またはCD3)、CD14、およびCD16に特異的なAbsを含める必要があります。
- 10倍の余剰量の滅菌PBSを細胞に加え、600 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 等量のストレプトアビジン結合マイクロビーズ(106細胞あたり5 μL)をペレットに加え、十分に混合します。
- 15 mLのプラスチック製円錐チューブで氷上で30分間インキュベートします。
- 2 mLのPBSバッファーをチューブに加えます。
- チューブを磁気スタンドに入れ、室温で8分間インキュベートします。茶色のマイクロビーズは、磁石の隣のチューブ壁に徐々に付着します。
- チューブを磁気スタンドに残した状態で、上清を新しい滅菌15mLチューブに慎重に移します。
- 手順1.14から1.16を繰り返し、手つかずのB細胞を含む2つの上清を結合します。マイクロビーズを捨てます。
- 室温で600 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- ペレットをRPMI 1640培地に再懸濁して、下流の実験に用いてください
手記：典型的には、10mLの末梢血から95%を超える純度の1〜5×105 B細胞を単離することができる。
2. 単離されたB細胞からの記憶細胞とナイーブB細胞の精製と分離
- ステップ1で精製した細胞を使用し、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞数を決定します。
- 600 x gおよびRTで5分間遠心分離した後、細胞を100 μLの冷たいPBSバッファーに再懸濁します。
- 106細胞あたり1 - 2 μgのビオチン化CD27 mAbを添加し、氷上で30分間インキュベートします。
- 10 mLのPBSバッファーをチューブに加え、600 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を捨て、細胞を50 μLのPBSバッファーに再懸濁します。
- 等量のストレプトアビジン磁気マイクロビーズ(1 - 2 μg/106細胞)を15 mLのプラスチック円錐チューブ内の細胞に加えます。
- よく混ぜて、氷上で30分間インキュベートします。
- 2〜3mLのPBSバッファーをチューブに加えます。
- チューブをマグネットスタンドに入れ、室温で8分間インキュベートして、茶色のマイクロビーズが磁石に最も近い側に付着します。
- チューブをマグネットスタンドに入れた状態で、上清画分を新しい滅菌チューブに慎重に移します。この画分には、濃縮されたCD27-ナイーブB細胞が含まれています。
- マイクロビーズが入ったチューブに5mLを加え、マイクロビーズ(すなわち、CD27+メモリーB細胞の濃縮画分)を穏やかに再懸濁します。
- 室温で600 x gで5分間遠心分離し、ペレットをRPMI 1640培地で再懸濁して下流の実験に用いる
手記：典型的には、B細胞の~30〜60%は、健康なドナーのPBMCからCD27+メモリー細胞として精製することができます。
3. ナイーブB細胞、メモリーB細胞、PB/PCの集合体に対する細胞選別
- ステップ1で精製した細胞を用いて、血球計算盤または自動セルカウンターを用いて細胞番号を決定します。
- 細胞を5mLポリスチレンチューブ内の1mLあたり10.7の濃度で冷たいPBS緩衝液に再懸濁します。
- 106細胞あたり1〜2 μgのヒトIgGを添加し、Fcブロックについて氷上で10分間インキュベー
トします。
- 抗CD19-APC(クローン:HIB19)、抗CD27-eFluor450(クローン:O323)、および抗CD38-PE(クローン:HIT2)を6細胞10個につき各1μg加え、よく混合し、氷上で30分間インキュベー
トする。
- ステップ3.4の最後の5分間に、市販の7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)を5 μL加えます。
- 2 mLのPBSをチューブに加え、ボルテックスで600 x gで5分間遠心分離します。
- 15 mLチューブ内で、1 mLあたり1 - 5 x 107細胞の濃度でソーティングバッファー(2% BSAおよび2 mM EDTAを含む滅菌PBS)に細胞を再懸濁します。
- ナイロンメッシュのセルストレーナー(孔径40μm)で細胞をろ過し、細胞の凝集体を排除します。
- 紫色(405 nm)、青色(488 nm)、赤色(640 nm)の3つのレーザーを搭載したフローサイトメトリーソーターで細胞を分離します。
手記：青色レーザーだけでも、3色フローサイトメトリーには十分です。
- ナイーブB細胞(CD19+CD27-)、メモリーB細胞(CD19+CD27+)、PB/PC(CD19+CD27+/hiCD38+)を同時に収集するために、細胞を3本の15 mLチューブ(5 mLのRPMI培地を含む)に選別します。
手記： 選別されたナイーブB細胞およびメモリーB細胞は、ステップ4で説明したように培養できます。
4. 単離されたヒトCD19+ B細胞、CD19+CD27+メモリーB細胞、CD19+CD27-ナイーブB細胞のin vitro分化
- ステップ1.19、2.10、2.11、および3.10で精製した細胞を使用して、血球計算盤または自動セルカウンターで細胞番号を決定します。
- RPMI 1640培地で細胞を1 mLあたり1 - 10 x 105の濃度で再懸濁し、12ウェルプレートのウェルに分注します。
- CpG(ODN 2006)を5 μg/106細胞/mLで添加します。
- 細胞を37°Cインキュベーターで5%CO2とともに5日間培養します。
- 各ウェルから細胞を採取し、別々に15 mLチューブに入れ、各チューブに5 mLのPBSを加え、600 x gおよびRTで5分間遠心分離します。
- 血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。細胞を1 mLあたり1 - 10 x 105の濃度でRPMI 1640培地で再懸濁します。
5. ELISpot アッセイ
- 蒸留水中の35%エタノール30μLをELISpotプレートの各ウェルに30秒間加えます
手記：ピペッティングの際は、常にウェル内のメンブレンに触れないようにしてください。
- ELISpotプレートを反転させてエタノールを除去します。
- オートクレーブ処理したddH2Oを150 μLを各ウェルに入れ、室温で5分間インキュベートして残留エタノールを洗い流し、その後、滅菌PBSを室温で3分間洗浄します
手記：ステップ5.1から5.3は、プレートの製造によってはオプションになる場合があります。
- 5 μg/mL ポリクローナル F(ab')2 フラグメントの抗ヒト Ig (IgG + IgM + IgA) (PBS 中) を 50 μL を ELISpot プレートの各ウェルに入れ、4 °C で一晩 (推奨) または 37 °C で 2 時間インキュベートします
手記：プレートの端は、使用するまでパラフィルムでシールします。
- プレートを反転させて未結合のAbsを除去し、各ウェルに200 μLのPBSを加え、RTで毎回3分間2回インキュベートします。
ブロッキング- のために各ウェルに5% BSA(またはRPMI 1640培地)を含むPBS200 μLを添加し、室温で2時間インキュベー
トします。
- プレートを反転させて、ブロッキングバッファーを取り外します。ステップ5.5のように、各ウェルを200μLのPBSで2回洗浄します。
- 各ウェルに100 μLのRPMI 1640培地を加え、37°Cでインキュベー
トします。
- 細胞を播種する準備ができたら、プレートを反転させてRPMI 1640培地を取り出します。
- 100 μL (5 x 104)、50 μL (2.5 x 104)、および 25 μL (1.25 x 104) の細胞 (ステップ 1.19、2.10、2.11、3.10、および 4.6) を ELISpot プレートのウェルに播種します。RPMI 1640 メディウムでは、容量を 150 μL/ウェルにします。
手記：細胞をプレーティングするために、最低1つまたは2つの2倍段階希釈液が推奨されます。
- 37°Cのインキュベーターで5%CO2を入れたプレートを8〜14時間インキュベー
トします。
- プレートを反転させて、細胞とRPMI 1640培地を取り出します。
- 200 μL/ウェルのPBS-T(PBSと0.05% Tween 20)を加え、RTで5回、各回3分間インキュベー
トします。
- ヤギ抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ(AP)、Fcγ特異的Abs(IgG検出用、PBS-Tで1:5,000)、またはヤギ抗ヒトIgM-AP、Fcμフラグメント特異的Abs(IgM検出用、PBS-Tで1:5,000)のいずれかを指定ウェルに添加し、暗所でRTで2時間インキュベートします。
- ステップ5.5のように、各ウェルを200μLのPBSで2回洗浄します。
- ブロモクロロインドリルリン酸-ニトロブルーテトラゾリウム(BCIP/NBT)基質溶液を50 μL/ウェル加えます。紫色の斑点は通常5〜15分で現れます。
- 100 μL/ウェルのddH2Oを添加して、シミの過剰発生を防ぎます。
- すべてのスポットが完全に現像した後、流水でプレートをすすぎます。
- プレートのアンダードレインを取り外し、暗闇で風乾させます。
- 画像取得/分析ユニットを備えた自動プレートリーダー(自動スキャナーや解剖顕微鏡による手動など)を使用してスポットをカウントします
手記：プレートは、暗闇の中でRTで保管し、後で分析することができます。
