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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. コレクションチューブの準備
- Minimum Essential Medium αExpression(MEM α)に10%のウシ胎児血清と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを添加して、BMSC培地を作製します。
- 100 μLのBMSC培養培地を1.5 mLの微量遠心チューブに入れます。通常、1本のチューブに3つの骨が収まるため、それに応じて準備します。
- 200 μLのピペットチップの端を、遠心分離チューブに収まるように十分にカットします。チューブの内側にチップを挿入し、蓋が閉まることを確認してから、チューブを氷の上に置きます.
手記：あるいは、端部がカットされた0.75 mLの微量遠心チューブを1.5 mLの微量遠心チューブに挿入することもできます。
2. マウスからの骨の収穫
- CO2を使用して動物を安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行い、70%エタノールを噴霧します
手記：同性、できれば同じ年齢の動物が使用されていることを確認してください。私たちは定期的に7〜8週齢の動物を使用しています。実験群ごとに少なくとも3匹の動物から細胞をプールして、より代表的で再現性の高い細胞集団を得ることをお勧めします。
- 安楽死させたマウスを仰向けに解剖ボードの上に置きます。鉗子を使用して、腹部に皮膚のテントを作成します。滅菌解剖ハサミを使用して小さな切開(約1cm)を行います。切り口から手足に向かって皮膚をはがし、下腹部と脚を露出させます。
- 足首の関節の下を切って足を取り除きます。腰の腸骨稜に沿ってカットして、大腿骨の頭を腰骨から分離します。マウスがまだ仰向けになっている間に、腰骨の中央に切開を行い、2つの腸骨を分離します。
- 糸くずの出ないワイプを使用して、大腿骨、脛骨、腸骨から筋肉を慎重に取り除きます
手記：骨からできるだけ多くの腱と筋肉を切除すると、糸くずの出ないワイプ(キムワイプなど)を使用して、クリーニングがより迅速かつ簡単になります。骨は簡単に壊れる傾向があり、特定の遺伝子型では骨の脆弱性が増す可能性があるため、骨を操作するときは注意してください。
- すべてのサンプルが解剖されたら、それらを氷上のPBSに入れ、分離の残りのステップのために滅菌培養フードに移動します.
手記：可能な限り無菌的に作業することで、培養物の汚染の可能性を減らすことができます。
- 骨の近位端と遠位端の両方に小さな切り込み(約1〜2 mm)をしてから、遠心チューブ内の切片の先端に骨を配置します。
手記：骨髄を遠心分離できるように、十分な量をカットするようにしてください。ただし、細胞集団は骨髄空間内の近接性に基づいて変化する傾向があるため、切りすぎないように注意する必要があります。
- 10,000 x gで15秒間、室温で遠心分離します。骨がインサート(200 μLピペットチップまたは0.75 mL微量遠心チューブ)内にある間、すべての骨髄が1.5 mLチューブの底で洗い流され、ペレット化されていることを確認してください。すべての骨髄が収集されたら、骨の入ったインサートを収集チューブから取り外します。
手記：すべての骨髄が洗い流されると、骨は白く見えます。ただし、骨髄が特定の骨に残っている場合は、端を切って遠心分離してみてください。
>3. 細胞懸濁液
- 25 Gの針を使用して、細胞ペレットをゆっくりと上下に引っ張り、凝集塊を分割し、すべてのサンプルを1つの15 mLコニカルチューブに結合します。サンプル500 μLあたり10 mLのBMSC培地を添加します。
- 50 mLのコニカルチューブの上に70 μmフィルターを置き、このフィルターに細胞懸濁液を通して、骨片を除去することができます。
>4. 骨髄細胞の混合集団(総BMCs)のプレーティングと培養
>注:細胞は、5%のCO2を含むインキュベーターで37°Cで培養されます。
- 細胞数を計算し、培地中で1.0 x 106細胞/cm2でプレートします。細胞が付着するまで72時間の混合培養を行います。
手記：細胞懸濁液を培養培地で20倍に希釈し、再度トリパンブルーで希釈してから、血球計算盤を使用して細胞をカウントすることをお勧めします。7週齢の雄C57Bl6/Jマウスの場合、通常、約50 x 106細胞の細胞数が得られますが、年齢、性別、および系統は細胞数に大きく影響する可能性があります。
手記：細胞の混合集団は、培養ウェルの底に付着する必要があります。
- 72 時間経過したら、メディアを取り外し、新しいメディアと交換します。一日おきにメディアを交換し続け、合流点を確認します。細胞が80-100%の密度に達すると、分化の準備が整います。
手記：この培養物はBMSCとHSCの両方と混合されているため、骨芽細胞形成、脂肪形成、破骨細胞形成に直接使用できます。
>5. BMSC(付着性BMSC)の分割集団のプレーティングと培養
>注:細胞は、5%のCO2を含むインキュベーターで37°Cで培養されます。
- 1匹のマウスの大腿骨、脛骨、腸骨から採取したすべての細胞を10cmの培養皿(培養面積の55cm2)にプレートします
手記：2-3匹のC57BL/6Jマウスをプールする場合、通常、この「総」骨髄集団を150 cm2フラスコに播種します。
- 混合培養の48時間後、培地(非接着性HSCを含む)を取り出します。破骨細胞形成実験を行う場合は、この非接着性細胞の集団を脇に置き、そうでない場合は、これらの細胞を吸引して廃棄します。
- プレート/フラスコは、付着した細胞を邪魔しないようにPBSで慎重に洗ってください。
- PBSを除去し、0.25%トリプシンを添加し、37°Cで1〜3分間インキュベートして細胞を持ち上げます。この時点で、持ち上げられたBMSCをカウントし(ステップ4.1で以前に行ったように)、将来の実験のためにメッキすることができます。
- めっきに必要なセル数を計算します。必要量の細胞懸濁液を1,000 x gで室温で5分間遠心分離します
手記：細胞は通常、エンドポイント実験に基づいてプレーティングされます。例えば、タンパク質/RNAを単離する場合、通常は高密度(6ウェルプレートに~1.0-2.0 x 106細胞/ウェル)でプレートします。
- 培地を取り出し、プレーティングに必要な量の培養培地に細胞ペレットを再懸濁します。実験に従って細胞を培地に播種し、数日間接着させます。BMSCがコンフルエントに達したら、微分の実行に進みます。
6. BMSCの区別
- 脂肪細胞
- 90 mLのDulbecco Modified Eagle Medium(DMEM)高グルコース、10 mLのウシ胎児血清、1 mLのペニシリン/ストレプトマイシン、100 μL 20 mMロシグリタゾン、および100 μLの2 mMインスリンを混合して、脂肪細胞ベース培地を作製します。必要に応じて、分化実験中の1週間、この培地を4°Cで保存します。
- 200 μL の 62.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX) と 25 μL の 1 mM デキサメタゾンを 25 mL の脂肪細胞ベース培地に添加して、脂肪細胞誘導培地を作製します。
- BMSC 培養物(ステップ 4.3 の合計 BMC またはステップ 5.6 の接着性 BMSC)がコンフルエントになったら、培地を脂肪細胞誘導培地に変更します。この差別化の0日目を考えてみましょう。
- 48時間後、培地を取り出し、脂肪細胞誘導培地で培養をリフレッシュします。
- 4日目に、脂肪細胞ベース培地に切り替えます.
手記：脂肪滴は、2日目または4日目から現れ始めることがあります。
- 7日目に、細胞が最大の脂肪滴を蓄積し、成熟脂肪細胞と同様の表現型を示すことを観察します。この点を超えて培養すると、細胞死/剥離を引き起こす可能性があるため、培養しないでください。