ヒト末梢血単核細胞からの活性化T細胞の培養

要約

出典:Mølgaard, K., et al.サイトカイン分化ヒト初代T細胞におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイムモニタリング。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオでは、ヒトの初代T細胞活性化のためのプロトコルについて説明します。ナイーブT細胞を抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングした磁気ビーズでインキュベートし、続いてインターロイキン-2またはインターロイキン-15処理を行うと、ナイーブT細胞が活性化され、エフェクターT細胞またはメモリーT細胞に分化および増殖します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

>1. 活性化ヒト初代Tリンパ球の培養

1. 細胞の解凍(1日目)
   1. 10 mLのRPMI 1640をサンプルあたり約37°Cに予温します。
   2. 必要な数の末梢血単核細胞アンプルを採取し、ドライアイス上に一時的に保管します。
   3. 凍結細胞を予熱したRPMI 1640 10 mLに再懸濁します。
   4. 細胞を500 x g、RTで5分間遠心分離します。
   5. 上清を捨て、10 mLのRPMI 1640に再懸濁して細胞を再度洗浄し、1.1.4に記載されているように遠心分離します。
   6. 上清を廃棄し、X-VIVO 15培地+ 5%ヒト血清(以下:T細胞培地)のmLあたり2 x 10⁶細胞で細胞を再懸濁します。
   7. 24ウェル細胞培養プレートでウェルあたり2 mLの細胞をプレート化し、37°Cおよび5%CO₂で一晩インキュベートします。
2. 細胞の活性化(0日目)
   1. CD3/CD28ビーズは、100万細胞あたり12.5μLのビーズを微量遠心チューブに移して洗浄します。ビーズ12.5μLあたり12.5μLのPBSを添加します.
      手記：使用前にビーズのバイアルをボルテックスすることが重要です。
   2. 微量遠心チューブを適切な磁石に1分間置きます。
   3. バッファーを廃棄し、ビーズを元のT細胞培地の容量(ビーズの元の容量12.5 μLあたり12.5 μLのT細胞培地)に再懸濁します。
   4. 1:2の比率に対応する細胞100万個あたり12.5μLのビーズを添加します(ビーズ:細胞)。
   5. 細胞を2つの条件に分割し、それぞれに約500万個の細胞を入れます。
   6. 表1に記載されているように、正しい量のサイトカインを条件に加えます。
   7. 細胞を37°Cおよび5%CO₂で3日間インキュベートします。
3. 細胞の培養(3日目と5日目)
   1. 細胞を再懸濁し、各ウェルから体積の半分を新しいウェルに移すことにより、細胞を分割します。各ウェルに同量の新鮮T細胞培地を添加します。
   2. 表1に記載されているように、各条件に新しいサイトカインを追加します。

円 名

	サイトカイン	株式	希釈係数	最終的な
コンディション1	IL-2	3 x 106 U/mL	30,000	100 U/mL
コンディション2	IL-15	2 x 105 U/mL	2,000	100 U/mL

>表1:T細胞の代謝変化をガイドするために使用されるサイトカイン培養物の調製。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェル組織培養プレート	ヌンク	142485
抗CD3xCD28ビーズ	ギブコ	11161D
X-VIVO 15	ロンザ	BE02-060F
ヒト血清	シグマ・アルドリッチ	H4522-J	56°Cで30分間不活性化
IL-15	ペプロテック	200-02
IL-2	ペプロテック	200-15
リンポプレップ	ステムセルテクノロジー	7801
PBSの	サーモフィッシャー	10010023
RPMIの1640	Gibco-サーモフィッシャー	61870036
T細胞ビーズ磁石 DynaMag-2 Magnet	サーモフィッシャー	12321Dさん