マウス膵臓ドレナージリンパ節からの制御性T細胞サブセットの同定

要約

出典:Luo, Z., et al.フローサイトメトリーを用いたマウス胸腺、膵臓ドレナージリンパ節、および脾臓における制御性T細胞サブセットの決定。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、マウスの膵臓ドレナージリンパ節(PDLN)から単一細胞を単離するためのプロトコルと、フローサイトメトリーを使用して単一細胞集団からの制御性T細胞(Treg)の特性評価について説明します。Tregは、細胞表面マーカーCD4、CD25、Nrp1、および核転写因子Foxp3およびHeliosの陽性発現に基づいて同定されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. PDLNからのシングルセル分離

1. 滅菌済みの250 μm金属メッシュを、ラック内の15 mLコニカルチューブの上に置きます。メッシュを1mLのRPMIですすいでください。
2. リンパ節を金属メッシュに移し、ピンセットを使用してメッシュを通してそれらを研削します。金属メッシュに1mLのRPMIを塗布して、細胞をチューブに洗い流します。さらに3回繰り返して、メッシュを削除します。
3. チューブを433 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
4. 細胞ペレットを約5 mLのRPMIに再懸濁します。チューブにRPMIを充填します。
5. チューブを433 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
6. 細胞ペレットを約5 mLのRPMIに再懸濁します。チューブにRPMIを充填します。
7. チューブを433 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
8. 細胞ペレットを2mLのRPMIに再懸濁します。細胞懸濁液2 mLを、細胞ストレーナーキャップ付きの丸底チューブ5 mLに移します。細胞懸濁液を細胞ストレーナキャップに塗布します。

2. フローサイトメトリー

1. PDLNからの細胞懸濁液を433 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨てます。
2. 100 μL のフローサイトメトリー染色バッファー (FACS バッファー) で細胞を染色します: 0.75 μg/100 μL FITC 標識 CD4 抗体、0.60 μg/100 μL APC-H7 標識 CD8 抗体、0.30 μg/100 μL PE 標識 CD25 抗体、5 μL (1: 20) APC 標識 Nrp1 抗体。チューブを氷上で40分間インキュベートします。
3. 各チューブに200μLのFACSバッファーを加えます。チューブを433 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。もう一度繰り返します。
4. 細胞ペレットを500 μLの透過化固定バッファー(PFB)に再懸濁することにより、細胞を固定および透過処理します。
   手記： PFBは、固定/透過濃縮液1部と固定/透過希釈液3部を混合して調製します。
5. チューブを冷蔵庫で4°Cで一晩保管します.
   手記：1時間のインキュベーションも機能します。
6. チューブを433 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
7. 細胞ペレットを500 μLの透過化洗浄バッファー(PWB)に再懸濁します。チューブを433 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
   手記：PWBは、Permeabilization Buffer(10x)を蒸留水で1:10に希釈することによって調製されます。
8. 100 μLのPWB中に以下の細胞内抗体を染色します:0.30 μg/100 μL PE-Cy7-conjugated Foxp3 antibody, 4 μL (1: 25) PacificBlue-conjugated Helios antibody.チューブを氷上で1時間インキュベートします。
9. 各チューブに500μLのプリント配線板を添加します。チューブを433 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
10. 細胞ペレットを500μLのプリント配線板に再懸濁します。チューブを433 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
11. 細胞ペレットを300μLのFACSバッファーに再懸濁します。
12. フローサイトメーターで細胞を解析します。
13. [Side Scatter-Area]、[Height]、および [Width (幅)] と [Forward Scatter (領域)、Height (高さ)、および Width (幅)] に基づいて 1 つのセルをゲートします。分析のために 100 万のイベントを実行します。
14. 実験のFCSファイルをエクスポートし、フローサイトメトリーアナライザーソフトウェアを使用して分析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI-1640	シグマ・アルドリッチ	R0883-500ミリリットル
eBioscience Foxp3 / 転写因子染色バッファーセット	サーモフィッシャー	00-5523-00	固定/透過濃縮液、固定/透過希釈液、透過化バッファー(10x)が含まれています
eBioscience フローサイトメトリー染色バッファー	サーモフィッシャー	00-4222-26
CD4 モノクローナル抗体 (RM4-5), FITC, eBioscience	サーモフィッシャー	11-0042-85
CD25 モノクローナル抗体 (PC61.5), PE, eBioscience	サーモフィッシャー	〒12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7ラット抗マウスCD8a	BDバイオサイエンス	560182
マウス Neuropilin-1 APC 標識抗体	R&Dシステム	FAB5994A
FOXP3 モノクローナル抗体 (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	サーモフィッシャー	25-5773-82
Pacific Blue 抗マウス/ヒト Helios 抗体	バイオレジェンド	137220
Falcon 5 mL 丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナースナップキャップ付き	コーニング	352235	35μmのナイロンメッシュがデュアルポジションスナップキャップに組み込まれています
チューブ 15 mL、120 mm x17 mm、PP	ザルシュテット	62.554.002
フローサイトメトリー	BDの
フローサイトメトリー解析ソフトウェア	イニバイ・テクノロジーズ	フローロジック

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