巨核球と血小板形成の分化のためのIn Vitro法

要約

出典:Perdomo, J., et al. ヒト臍帯血由来CD34+細胞からの巨核球分化と血小板形成。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、巨核球の分化と血小板の形成の技術を示しています。造血幹細胞(ヒト臍帯血から単離)は、トロンボポエチンの存在下で成熟した巨核球に分化します。成熟した巨核球は、プロプレートレットと呼ばれる細胞質の伸長を産生し、個々の血小板を生じさせます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 巨核球の分化

1. 12ウェルプレートのウェルあたり50 ng/mLの組換えヒトトロンボポエチン(rhTPO)を添加した2 mLのSFMに、5 ×^10個の5細胞/mL CD34⁺細胞を播種します。細胞を37°C、5%CO₂で加湿雰囲気でインキュベートします。解析に必要になる前に細胞がコンフルエントになっている場合は、細胞を回収し、新鮮な培地とrhTPOで複数のウェルに分割します
   手記： 2つまたは3つのウェルは、異なる時点(例:7日目、9日目、10日目)での分化をモニタリングするために特別に準備する必要があります。
2. 他のウェルの細胞を乱すことなく分化を監視するために取っておかれたウェルから細胞を回収します。
3. 最終容量100 μLの20 μL抗GPIIb/CD41-FITC抗体と10 μLの抗GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647抗体で細胞を染色し、それぞれのアイソタイプコントロール抗体を使用してコントロールチューブをセットします。4°Cで15〜30分間インキュベートします。
4. SB1mLを加えて洗浄します。400 × gで10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを200〜300μLのSBに再懸濁します。
5. 各蛍光色素について、アイソタイプコントロールを解析して、FITC および Alexa Flour 647 陽性集団のゲーティングを設定します。染色した細胞サンプルを分析して、成熟MKを表すCD41⁺/CD42a⁺ダブルポジティブ細胞の割合を決定します(図1C)。
6. 細胞表面マーカーを顕微鏡で可視化するには、1.3で説明されているように細胞を染色します。
   1. SB1mLを加えて洗浄します。400 × gで10分間遠心分離します。ペレットを100 μLのSBに再懸濁し、1,000 x gのスライドガラス上に5分間遠心します。細胞をメタノールに30秒間浸して、スライド上に細胞を固定します。自然乾燥させ、DAPIを含む20 μLの封入剤を加え(材料表を参照)、カバースリップで覆い、蛍光顕微鏡で可視化します(図2A)。
7. 細胞内抗原を可視化するには、細胞をPBSに再懸濁し、パラホルムアルデヒド(最終濃度1%)で室温で15分間固定します。細胞を透過化するには、triton-X 100(0.1%)を添加し、15分間インキュベートします。細胞を2 mL PBS/0.1% triton-X 100で洗浄します。100 μL の PBS/0.1% triton-X 100 に再懸濁し、抗 vWf 抗体と抗 CD62p 抗体 (希釈度 1:200) を添加し、室温で 30 分間インキュベートします。
   1. 2 mLのPBS/0.1% triton-X 100で洗浄し、400 × gで10分間遠心分離し、同じバッファーの100 μLに再懸濁し、抗マウスIgG-Alexa 594および抗ウサギIgG-Alexa 488(1:100)を添加します。室温で30分間インキュベートし、2 mLのPBS/0.1% triton-X 100で洗浄し、同じバッファーの100 μLに再懸濁し、20 μLの抗CD42b-APCを加えます。次に、ステップ1.6.1で説明したように細胞をスライドガラス上にスピンし、ステップ1.6.1で説明したように顕微鏡で可視化するためのサンプルを調製します。
8. 倍数性を決定するには、分化の12日目または13日目に細胞を採取します。SB1mLを加えて洗浄します。400 ×μCで10分間遠心分離し、最終容量100 μLの20 μL抗GPIIb/CD41-FITC抗体で染色し、4°Cで30分間インキュベートします。
   1. 1 mLのSBで1回洗浄し、20 μg/mLのヨウ化プロピジウムと0.05% Triton-X 100を含む300 μLの低張クエン酸緩衝液(1.25 mMクエン酸ナトリウム、2.5 mM塩化ナトリウム、3.5 mMデキストロース)にペレットを再懸濁します。光から保護した状態で4°Cで15分間インキュベートします。
   2. RNaseを最終濃度20 μg/mLまで添加し、光から保護した状態で4°Cで30分間インキュベートします。CD41-FITC⁺集団の30,000〜50,000のイベントを収集することにより、フローサイトメトリーによってヨウ化プロピジウムの強度を決定します(図2C)。

2. プロプラトレットカウント、血小板計数、および血小板活性化

1. 分化の8日目または9日目に細胞(ステップ1.1から)を回収し、50 ng/mL rhTPOを添加した200 μLの新鮮なSFMに48ウェルプレートで1 × 10⁴細胞/ウェルで播種します。37°C、5%CO₂.
   で5日間培養 手記： 定量目的で、シードウェルを三重にします。この低密度は、プロプレートレット含有MKの可視化とカウントに必要です。プロプレートレットは通常、培養の2日後に現れ始めます。ピークは4日目から5日目の間です。
2. 倒立型光学顕微鏡で、10倍または20倍の対物レンズを使用して、ウェル全体のプロプレート担持MKの数を数えます
   手記：加熱された(37°C)顕微鏡ステージは、細胞を室温に長期間保持するとプロプレートレット伸長部が収縮するため、好ましいです。プロプレートレットは、MK本体からの長い延長として観察されます。各MKは、いくつかのプロプレートレット突起を有することができる。プロプレートレットが発達するにつれて、MKの体のサイズは小さくなります。
3. 細胞を回収し、400 x gで室温で10分間遠心分離します。ステップ1.3および1.4で説明したように、20 μLの抗ヒトCD41-FITC抗体で細胞を染色します。プロプレートレット担持MK(pbMK)の割合を計算します:
   pbMK (%) = [(プロプレート担持MKs/ウェル)/(総CD41+細胞/ウェル)]×100
4. 培地に放出された血小板をカウントするには、パスツールピペットで細胞を穏やかに混合し、培養の14日目または15日目に100μLを回収します。
   1. 20 μLの抗ヒトCD41-FITC抗体で4°Cで20〜30分間染色し、それぞれのアイソタイプコントロール抗体を使用してコントロールチューブをセットします。
   2. 150 μLのSBと50 μLの計数ビーズを加えます。
   3. フローサイトメトリー解析では、FSCとSSCをlogスケールに設定します。セクション2.4.1で説明されているように、CD41-FITCで染色された多血小板血漿からの正常なヒト血小板を使用して、血小板のゲーティングを設定します(図3A)。
   4. 染色された血小板をフローサイトメトリーでビーズをカウントして分析します。FSC対SSCの散布図を使用して、カウントビーズの1,000イベントを収集します(図3A)。CD41-FITC陽性イベント(図3B)に基づいて、次の式を使用して血小板数を計算します:
      μLあたりの血小板=[(CD41-FITC陽性イベント数)/1,000ビーズ]×[(50μL中のビーズ数)/サンプル量]
5. 血小板の活性化を解析するには、パスツールピペットで細胞を穏やかに混合し、培養14日目または15日目に100 μLを回収します。1 mLのTyrode's buffer(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl₂、1.8 mM CaCl₂、0.2 mM Na₂HPO₄、12 mM NaHCO₃、5.5 mM D-グルコース、pH 6.5)を添加し、200 x gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。
   1. 上清を回収し、800 x gで10分間遠心分離して、血小板サイズの粒子をペレット化します。
   2. 上清を捨て、100 μLのTyrode's bufferに再懸濁します。20 μL の PAC1-FITC 抗体とアデノシン二リン酸 (ADP) を最終濃度 20 μM まで加え、室温で 20 分間インキュベートします。フローサイトメトリーによる解析により、FITC陽性事象の割合を判定します。ポジティブコントロールと同じ方法で処理した新鮮なヒト血小板を使用してください(図3C)。

結果

図1:培養中のCD34+細胞単離とMK分化のフローサイトメトリープロット。(A)ヒト臍帯血から精製した単核細胞(左図のようにゲート化)を抗CD34-PE抗体で染色し、試料中のCD34⁺細胞の割合を決定した(1.3%、右図)。(B)分離後、陽性画分を抗CD34-PE抗体および抗CD45 PerCP抗体で染色した。濃縮されたCD34⁺の集団は図(98.1%、右パネル、右上象限)に示されています。(C)CD34+細胞からin vitroで分化したMKを7日間または11日間、抗CD41抗体および抗CD42a抗体で染色した表現型解析。成熟したMKは、CD41⁺とCD42a⁺の両方に陽性です(右上の象限...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞培養試薬
組換えヒトTPO	ミルテニーバイオテック	〒130-094-013
ステムスパン SFEM II	幹細胞技術	9605	CD34+細胞用の無血清培地
フローサイトメトリーおよび細胞染色試薬
PEマウス抗ヒトCD34	BDバイオサイエンス	340669	クローン8G12。CD34の純度チェックにお使いいただけます。最終抗体濃度1:10希釈。
PerCPマウス抗ヒトCD45	BDバイオサイエンス	347464	1:10希釈
PerCPアイソタイプコントロール	BDバイオサイエンス	349044	1:10希釈
FITCマウス抗ヒトCD41a	BDバイオサイエンス	340929	最終抗体濃度1:5希釈。
APCマウス抗ヒトCD42b	BDバイオサイエンス	551061	この抗体は、成熟MK(通常、抗CD42aよりも陽性細胞の割合が低い)の検出にも使用できます。最終抗体濃度1:10希釈。
Alexa Fluor 647マウス抗ヒトCD42a	AbDセロテック	MCA1227A647T	現在、バイオ・ラッドが販売しています。最終抗体濃度1:10希釈。
Alexa Fluor 647マウスネガティブコントロール	AbDセロテック	MCA928A647	現在、バイオ・ラッドが販売しています。アイソタイプコントロール抗体
抗フォンWillebrand因子ウサギポリクローナル	アブカム	AB6994	1:200希釈
V450マウスアンチハムナCD41a	BDバイオサイエンス	58425	1:20希釈
V450アイソタイプコントロール	BDバイオサイエンス	580373	1:20希釈
PAC1-FITC抗体	BDバイオサイエンス	340507	1:10希釈
抗CD62pマウスモノクローナル	アブカム	AB6632	1:200希釈
Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギIgG	インビトゲン	A11008(英語)	1:100希釈
Alexa Fluor 594ヤギ抗マウスIgG	インビトゲン	A11020 (英語)	1:100希釈
Igアイソタイプコントロールカクテル-C	BDバイオサイエンス	558659	アイソタイプコントロール抗体
ヨウ化プロピジウム	シグマ・アルドリッチ	P4864
CountBright アブソリュート カウンティング ビーズ	分子プローブ、Invitrogen	C36950	ビーズのカウント
料
Falcon 5mL 丸底ポリプロピレン FACS チューブ、スナップキャップ付き、滅菌済み	In Vitro テクノロジー	352063
スライドガラス	メンツェル・グレイザー	J3800AMNZ
DAPIによるマウントメディア	ベクターラボラトリーズ	H-1200	DAPIによる退色防止用封入剤
備品
倒立顕微鏡	ライカ	DMIRB倒立顕微鏡
蛍光顕微鏡	ツァイス	バートA1
細胞分析装置	BDバイオサイエンス	FACSカントII
サイトスピン遠心分離機	サーモサイエンティフィック	サイトスピン4
ソフトウェア
細胞解析ソフト	BDバイオサイエンス	FACS Divaソフトウェア
シングルセル解析ソフトウェア	ツリースター	フロージョ
蛍光顕微鏡ソフトウェア	ツァイス	Zen 2 ブルーエディション