iPS細胞由来胸腺移民を作出する3次元胸腺培養システム

要約

出典:Vizcardo, R., et al.マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成するための三次元胸腺培養システム。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、iPS細胞由来の未熟T細胞から、三次元胸腺培養システムを用いて機能的な抗原特異的T細胞を作製するプロトコールを実演しています。iPS細胞由来の未成熟T細胞を内因性リンパ球枯渇マウスの胎児胸腺葉と共培養した結果、T細胞の成熟に成功し、CD8αβ+ MHCクラスI+ iPS細胞由来胸腺移動体(iTEs)を形成しました。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 3D iTEを生成するための胸腺臓器培養

1. マウス胎児胸腺葉を採取し、デオキシグアノシン(dGUO)処理により内因性リンパ球を展開させます。
2. dGUO 治療の 7 日目に、4 つの新しい 10 cm ディッシュを取り、それぞれに 20 mL の完全な培地 (Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanyl-L-glutamine + 1x sodium pyruvate + 1x minimum essential medium with non-essential amino acids (MEM-NEAA) + 1x penicillin-streptomycin + [1:1000] 2-mercapto ethanol)。
3. 胸腺葉を持つすべてのニトロセルロース膜を1つの10cm皿に移します。鉗子で個々の葉を膜から切り離し、それらを培地に沈めるようにします。メンブレンを廃棄します。RTで1時間インキュベートします。
4. 胸腺葉を完全な培地で新しい10 cmディッシュに移し、RTで1時間インキュベートします。この手順をさらに2回繰り返します。
5. 鉗子を使用して、胸腺葉を皿に固定し(一度に1つずつ)、もう一方の手で中央に100〜200μmの深さの切開を行い、葉の直径の半分を伸ばして、T細胞前駆細胞の葉への移動を促進します。
6. 胸腺葉を、完全分化培地(完全培地 + 5 ng/mL マウスインターロイキン-7 (IL-7) + 5 ng/mL マウス Flt3 リガンド (FLT3L) + 5 ng/mL 幹細胞因子 (SCF)) を充填した新しい 10 cm ディッシュに移します。
7. オプションで、下部および上部レベルのグリッドを備えた3D培養プレートを使用する場合は、吊り下げ液滴の蒸発と乾燥を防ぐために、両方のグリッドに滅菌PBSを充填します。
8. ステップ1.6のdGuo処理胸腺葉1個を含む30 μLの完全培地を、3Dカルチャープレートの各ウェルに移します。
9. OP9/DLL1共培養(16-21日目)から非接着性T系統細胞(iPS細胞由来未成熟T細胞)を採取し、20μL培地あたり2-5 x 10³ T系統細胞に再懸濁します。
10. 20 μLのT系統細胞懸濁液を3D培養プレートの各胸腺葉に加えます。5% CO₂ で 37 °C で一晩インキュベートします。
11. P200ピペットを30μLに設定し、各ウェルから数回ピペッティングした後、培地を吸引して胸腺葉を囲むすべての細胞を除去します。メディアを廃棄し、30 μLの完全なメディアを追加します。この手順を5〜7回繰り返して、葉に移動しない余分な未熟T細胞をすべて取り除きます。その後、毎日25〜30μLのメディアを交換します。
12. 4日目から5日目にかけて、葉の周囲にiPS細胞由来胸腺移動体(iTE)のハローが形成される様子を光学顕微鏡で確認します。
13. ローブを乱さずに培地をピペッティングすることにより、毎日iTEを収集します。毎日メディアを交換し、最大約12日間コレクションを継続します。
14. 回収されたiTEは、分子解析(図1、図2、図3、図4)やin vivo移植実験にすぐに使用できます。

結果

図1:iPS細胞由来の未成熟T細胞を播種した胸腺葉の免疫組織化学。上:iPS細胞由来未成熟T細胞の播種ありと播種なしの胸腺葉のH&E染色。上から2番目へ:DAPI(核)、CD3(T細胞)、およびマージで染色された切片ローブの共焦点画像。スケールバー = 100 μm。

図2:iTEは胸腺後T細胞の表現型を示しています。 (A)胸腺細胞、胸腺外T細胞(OP9/DLL1共培養系)、およびPmel...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-デオキシグアノシン	シグマ・アルドリッチ	312693-72-4
2-メルカプトエタノール (1,000x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21985年023月
FBSの	双子座	100〜500
Flt-3配位子	R&Dシステム	427-FL
インターロイキン-7	R&Dシステム	407ミリリットル
MEM非必須アミノ酸溶液	ギブコ	11140050
MEMパウダー	ギブコ	61100061
ピルビン酸ナトリウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11360-070
幹細胞因子(SCF)	R&Dシステム	455-MC
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140-122
リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 (1x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10010-023
RPMIの1640	ギブコ	11875093
10cm皿	コーニング株式会社	353003
Perfecta3Dハンギングドロッププレート	シグマ・アルドリッチ	HDP1096
鉗子	デュモン	0108-5PO
OP9/N-DLL1	理化学研究所バイオリソースセンター	猫#RCB2927;RRID:CVCL_B220
GlutaMAX (100倍)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050-061