末梢血単核細胞からのナチュラルキラー細胞のEx Vivo増殖

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 肝臓組織からのNK細胞の増殖(0日目)、図1に示すように。

>注:初期細胞数と生存率は、臓器摘出からの時間と初期組織サンプル量と強く相関しています。しかし、組織を30 mLのハンク平衡塩溶液(HBSS)に入れ、氷上または冷蔵庫で4°Cで一晩保管すると、NK細胞は高純度で増殖し、最大24時間後に生存率を得ることができます。

1. 生存可能な組織領域を特定し、滅菌済みの手術器具を使用して組織や切片からリンパ球を採取します。
2. 組織を30mLのHBSS(カルシウムまたはマグネシウムを含まない)に入れ、分離の準備が整うまで氷上に保ちます。
3. バイオセーフティキャビネット内の滅菌カミソリの刃またはハサミと鉗子を使用して、組織を<0.5cmの立方体にミンクします。
4. HBSS(10xコラゲナーゼIV:10 mg/mLまたは~200 U/mL)で10倍ストックを希釈し、1倍コラゲナーゼIV溶液(1 mg/mL)を調製します。
5. みじん切りにした組織片を組織解離チューブに入れます。チューブに4 g以下の組織を充填し、組織片を~10 mLの1xコラゲナーゼIV.
   に浸します。 手記：DNase Iの使用は、NKの生存率と収量をわずかに低下させる可能性があるため、推奨されません。使用する特定の組織解離チューブについては、材料表を参照してください。
6. 組織解離チューブを組織解離器に入れ、37°Cでブレンドして組織を完全にミンチにします
   手記：肝臓組織の場合、これには30分以上かかる場合があります。より砕けやすい組織の場合、約15分で十分な場合があります。特定の組織解離チューブおよび使用する組織解離剤については、材料表を参照してください。
7. 組織解離チューブを取り外し、5 mLシリンジの後端を使用して40 μmナイロンセルストレーナーでトライツします。溶離液を収集し、大きな未消化の断片を廃棄します。
8. 溶離液を400 x gで室温で5分間スピンダウンします。上清を吸引します。
9. 細胞ペレットを30%ポリビニルピロリドン(PVP)コーティングシリカに再懸濁して、最終的なリンパ球画分を汚染する脂肪細胞を除去します。
   1. 1x PVPコーティングシリカを調製するには、10x PBS.
      で9:1希釈のPVPコーティングシリカを使用します。 手記：使用される特定のPVPコーティングシリカについては、材料の表を参照してください。
   2. 30% PVP コーティングシリカを調製するには、1x PVP コーティングシリカを PBS/HBSS で希釈します。
10. 細胞ペレットを400 x gで室温で5分間スピンダウンします。上清を吸引します。
11. 細胞ペレットを9mLのR-10培地に再懸濁します.
    手記：R-10媒体の組成については、材料表を参照してください
12. 細胞懸濁液を4 mLのFicollまたはリンパ球分離培地に慎重に重ねて、赤血球および多形核細胞からリンパ球を分離します。
13. 加速とブレーキをオフまたは最低の設定で室温で400 x gで23分間遠心分離することにより、層を分離します。上中層を慎重にデカントし、組織浸潤リンパ球を含む間期を採取します。
14. 10 mLの培地で細胞をすすぎ、細胞カウント、フローサイトメトリー、分注、細胞の凍結、または一次NK増殖プロトコルに進みます。

2. PBMC(またはCBまたは臓器組織)からの初代NK細胞の増殖(0日目)、図2に示すように。

1. 凍結したPBMCと凍結した照射済みフィーダー細胞を37°Cの水浴で解凍します。
2. PBMC細胞と100個のガンマ線照射(Gy照射)221-mIL-21細胞を、400 x gで5分間遠心分離し、10 mLのR-10培地で別々に洗浄します。
3. Save 1 x 10⁶ cells of PBMC for flow cytometry.
   手記：NK細胞の初期純度は、NK細胞の増殖速度を計算する上で重要な要素です。
4. 細胞を1 mLのR-10培地に再懸濁します。トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。
5. PBMCの5 x 10⁶細胞と10 x 10⁶細胞の10 x 6細胞を100 Gy照射した221-mIL-21細胞を特別な6ウェルプレートで混合します(材料の表を参照)。
6. ヒトIL-2(200 U/mL)およびヒトIL-15(5 ng/mL)を添加したR-10培地30 mLを添加します(材料表を参照)。
7. 特殊な6ウェルプレートを37°Cで5%CO₂とインキュベートします。
8. 培地をヒトIL-2(200 U / mL)およびヒトIL-15(5 ng / mL)を添加したR-10培地と交換して、NK細胞を3〜4日ごとに維持します><。 手記：ウェルあたり20 x 10⁶細胞未満を維持し、各培地交換でさらに増殖します。最高の生存率を得るには、各ウェルの総細胞数が100 x 10⁶細胞を超えないようにしてください。
9. 総細胞数、生存率を記録し、3〜4日ごとにフローサイトメトリーを実行してNK細胞の増殖率を計算します。

図1:ヒトの固形臓器サンプルからのNK細胞増殖の図。 簡単に言うと、得られたヒト肝臓サンプルは、機械的分解のために小さな立方体にミンチされます。解離した細胞は、PVPコーティングされたシリカとリンパ球分離培地を使用して単離されます。さらに、NK細胞は、図2に記載の増殖プロトコルを用いて増殖する。

図2:PBMCからのCAR-NK細胞生成の概略ワークフロー。 簡単に説明すると、221-mIL21フィーダー細胞を100Gyで照射した後、0日目にIL-2およびIL-15を添加したPBMCと共培養しました。並行して、293T細胞をレトロウイルスパッケージングシステムでトランスフェクションしてCARレトロウイルスを産生し、IL-2およびIL-15の存在下で増殖したPBNK細胞に形質導入しました。初代CAR-NK細胞は7日目に回収され、21日間増殖を続けました。この図は、Yang et al.