ヘルパーT細胞と抗原提示細胞との間の免疫学的シナプス形成

要約

出典:Bello-Gamboa, A. et al., Imaging the Human Immunological Synapse.J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、抗原提示細胞とヘルパーTリンパ球との間の免疫学的シナプス形成のin vitro研究を蛍光顕微鏡を用いて示しています。ヘルパーTリンパ球のT細胞受容体は、抗原提示細胞内の抗原-MHC-II複合体と相互作用して免疫学的シナプスを形成し、続いて分泌小胞がシナプスに向かって移動し、蛍光顕微鏡で可視化されます。

プロトコル

1. Raji細胞を接着するためのスライドの準備

1. ウェルあたり150 μLのフィブロネクチン(100 μg/mL)を8マイクロウェルチャンバースライド(プラスチックボトムチャンバースライド)に加え、37°Cで30分から1時間インキュベートします。この接着基質は、Raji細胞のウェルボトムへの結合(ステップ2)、Jurkat細胞との生きたコンジュゲートの形成(ステップ4)およびタイムラプス顕微鏡キャプチャ(ステップ6)を可能にし、その後のオプションのパラホルムアルデヒド(PFA)固定とも互換性があります。
   注:アセトンの固定には、アセトンがプラスチックを溶解するため、フィブロネクチンの代わりにガラス底のチャンバースライドとポリ-L-リジン(20μg/mL)を使用してください。8マイクロウェルチャンバースライド(1 cm²ウェル、最大容量300 μL)または同等品は、柔軟で適切なフォーマットです。
2. 200 μLの自動ピペットを使用してフィブロネクチンを吸引し、各ウェルを200 μLのPBSで2分間穏やかに振とうしながら洗浄します。このウォッシュをもう一度繰り返します。チャンバースライドは、この段階でPBSを使用して4°Cで1〜2週間保存できます。

2. チャンバースライドへのRaji細胞の接着と7-アミノ-4-クロロメチルクマリン(CMAC)の標識

1. Raji細胞のコンフルエント(1-2 x 10⁶細胞/mL)前培養液10 mLを15 mLのV底チューブに移します。よく混合し、10 μLを使用して、ノイバウアーチャンバーまたは同等品の細胞をカウントします。
2. 残りの細胞を300 x gで室温で5分間遠心分離します。上清を吸引して捨てます。
3. 細胞ペレットを温かい完全培養培地(RPMI 1640に10% FCS、2 mMグルタミン、10 mM HEPES、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを添加)に10⁶細胞/mLの濃度で穏やかに再懸濁します。以下の式を使用してください:
   ([ ]_{initial x} V_initial = [ ]_final x V_final)、ここで、[ ]_initialは初期細胞濃度、V_initial =細胞懸濁液の初期容量、[ ]_{final =最終}細胞濃度、V_final =細胞懸濁液の最終容量
   注:開始培養の細胞濃度によっては、必要以上の細胞を収集することも可能ですが、潜在的な問題を防ぐために、実験が終了するまで残りの細胞を培養(37°C)に維持することが重要です(ステップ2.6を参照)。
4. Raji細胞を標識して、シナプス結合体形成中の同定を可能にします。この実験では、ステップ2.4.2で7-アミノ-4-クロロメチルクマリン(CMAC)の標識を行います。
   1. 培地中の必要な数のRaji細胞を2mLチューブに移します。8 マイクロウェルチャンバースライドには、合計 1.6 mL の細胞懸濁液が必要です(ウェルあたり 200 μL)。
   2. CMACを最終濃度10 μMまで添加します。CMACは光感受性があるため、チューブをアルミホイルで覆って細胞を暗所に保ちます。1 cm²ウェルあたり2 x 10⁵個のRaji細胞を含む200 μLが必要です。したがって、8つのウェルを調製する必要がある場合は、1.6 x 10⁶ Raji細胞が必要です。
      注:Raji細胞をセルトラッカーブルー(CMAC、UV励起、および青色発光)で標識すると、シナプスコンジュゲートが形成されたときにRaji細胞がTh細胞と区別されます。この色素は、PFAおよびアセトン固定剤と互換性があり、さらなる免疫蛍光染色手順を可能にします。軽い露出は避けてください。CMACでプール内のRaji細胞を標識し、続いて再懸濁してからRaji細胞をフィブロネクチンコーティングチャンバースライドに接着することで、異なるウェル間でRaji細胞をCMACで均一に標識することができます。
5. CMAC染色した細胞を再懸濁し、ステップ1.2からチャンバースライドでPBSを吸引した後、ステップ1.1-1.2で調製したフィブロネクチンコーティングチャンバースライドの各ウェルに細胞懸濁液200μLを移します。チャンバースライドを37°C、5%CO₂で30分間-1時間インキュベートします。
   注:接着とCMACラベリングはこのステップで同時に行われるため、時間を節約できます。Raji細胞はすぐに沈殿するため、播種前に細胞懸濁液中の濃度を均一に保つように注意する必要があります。CMACの洗浄はステップ2.7(標識されたRaji細胞がすでにチャンバースライドに付着している場合)でより簡単に行われるため、この段階では遠心分離によってCMACを洗浄する必要はありません。CMACは細胞懸濁液中に過剰に大量に存在するため、青色蛍光バックグラウンドが高すぎて青色染色細胞を区別することができません。CMAC洗浄後のステップ2.7で細胞のCMAC蛍光を確認します。
6. 顕微鏡でチャンバースライドを静かに振って、Raji細胞がウェルの底に付着していることを確認します。セルが互いにギャップを示し、コンフルエントでないことを確認します(図1、中央のパネル)。細胞のコンフルエントの50-60%が適切です。
   1. ほとんどの細胞がチャンバースライドに効率的に接着し、細胞の隙間が観察されない場合は、各ウェルを温かい完全培地で洗浄し、200 μLの自動ピペットで培地を再懸濁して、余分な細胞を分離します。各再懸濁ステップの後に confluence を確認します。
   2. 細胞が接着しない場合は、接着ステップを再度繰り返し、接着時間や細胞数を増やします
      注:ここで停止し、チャンバースライドを37°C、5%CO₂で一晩(O / N)インキュベートし、翌日にプロトコールを続行することが可能です。翌日、Raji細胞が接着し、CMAC標識されていることを蛍光顕微鏡で確認してください。
7. 温かい補充されたRPMIで各ウェルを再度注意深く洗浄して、余分なCMACを除去し、蛍光顕微鏡で青色発光を確認します(図1).
   注:液浸油(粘着性および粘性)および高開口数オイル対物レンズの使用を避けるために、超長距離(つまり、20倍または40倍)対物レンズを使用して、蛍光顕微鏡を使用してCMAC標識を迅速にチェックできます。

>3. CMACのパルス — ブドウ球菌エンテロトキシンEでRaji細胞を標識

1. ブドウ球菌エンテロトキシンE(SEE、1 μg/mL)を各ウェルに加えます。SEEは、SEE凍結ストック(PBSで1 mg/mL)から細胞培養培地(100 μg/mLのワーキング溶液)で簡便に希釈できます。200 μLマイクロウェルあたり2 μLの100倍ワーキング溶液を使用してください。
   注意: この手順では手袋を使用し、使用済みのチップはバイオハザードボックスに廃棄してください。
2. チャンバースライドを37°C、5%CO₂で少なくとも30分間インキュベートします。SEE効果は少なくとも3〜4時間持続します
   注:SEEは、個別のタイムラプスセットアップが計画されている場合(ステップ5)、および/またはエンドポイント実験の開始時点(ステップ6)に応じて、必要に応じて異なる時点でウェルに追加できます。

4. Jurkat細胞の調製

1. この実験には、以前に増殖したJurkat細胞(1-2 x 10⁶細胞/mL)の培養物を使用してください。標準的な培養フラスコの細胞、または前述した標準的なエレクトロポレーションプロトコルに従って以前のトランスフェクションから採取した細胞を使用してください。Jurkat細胞のトランスフェクションにより、生細胞内の分泌顆粒の輸送をタイムラプスで可視化することができます。例えば、MVBのマーカーであるGFP-CD63を発現させると、GFP-CD63で修飾した小胞の動きを記録することができます。
2. 位相差顕微鏡で細胞を観察します。過剰な死細胞(>20-30%)が観察された場合は、標準的なプロトコルを使用してFicoll密度勾配遠心分離を行い、使用前に過剰な死細胞(死細胞は生細胞よりも高い密度を示す)を排除します(ディスカッションを参照)。
3. 細胞を15 mLチューブ、Vボトムチューブに移し、血球計算盤を使用して10 μLを使用してカウントします。
4. ステップ2.2で説明したように、残りの細胞を遠心分離します。上清を捨て、新鮮で温かい培地を使用して、Raji細胞と同じ濃度(1 x 10⁶ / mL)で細胞を再懸濁します。手順2.2〜2.3に従います。
5. Jurkat細胞を培養(37°C、5%CO₂)で保持し、ステップ4.
   注:2番目のオプション(トランスフェクション)では、生細胞の数は最初のオプションよりもはるかに少なくなります。したがって、実験に十分な細胞を持つために、より高い開始細胞培養量を使用することを検討してください。エレクトロポレーションキュベットおよびトランスフェクションあたり10 x 10⁶ Jurkat細胞から、トランスフェクションの48時間後に生存するのは2〜4 x 10⁶ Jurkat細胞のみであり、これらの細胞の一部はFicollステップ中に失われます。したがって、8つのマイクロウェル(1.6 x 10⁶トランスフェクトされたJurkat細胞が必要)からの接着したSEEパルスRaji細胞に挑戦するには、一般に1つのエレクトロポレーションキュベットで十分です。

5. Raji細胞とJurkat細胞の共播種

1. ステップ3.2から、CMAC標識、SEEパルス、接着Raji細胞を含むチャンバースライドをインキュベーターから取り出します。CMACは以前にステップ2.7で行っていたため、この段階では洗う必要はありません。
2. 自動200μLピペットを使用して、ウェルの片隅から各ウェルの培地を1つずつ慎重に吸引します。井戸の中の培地を完全に乾かさないでください。
3. ステップ4.5で調製した細胞培養培地(1 x 10⁶/mL)中の200 μLの再懸濁Jurkat細胞と直ちに培地を交換してください。タイムラプスイメージングを行う場合は、Jurkat細胞が非常に迅速に沈殿してシナプス抱合を形成する傾向があるため、このステップの直後にステップ6に進みます。便宜上、この段階ではJurkat細胞の播種を受けていないSEEパルスの接着Raji細胞を含むマイクロウェルは、その後のJurkat細胞への挑戦まで細胞培養培地で維持する必要があります。これにより、その後のJurkat細胞によるチャレンジを柔軟に行い、タイムラプスや逆動態のエンドポイント実験アプローチ
を追加することができます。
4. タイムラプスを行う場合は、すぐに手順6に進んでください。これには、シナプス結合の形成と同時画像取得を可能にするために、顕微鏡ステージインキュベーターまたは同等の37°C、5%CO₂で1〜2時間共培養することが含まれます。エンドポイント分析が予見されるが、タイムラプスがない場合は、細胞を固定する前に、顕微鏡(図1のように)を使用して共培養期間後のコンジュゲート形成を確認します。

6. 新興シナプスコンジュゲートのタイムラプスイメージング

1. イメージングの前に、顕微鏡とインキュベーションチャンバーを準備します。この例では、詳細な顕微鏡設定を図2.
   に示します。 注:タイムラプス実験を計画している場合は、接着したRaji細胞を含むチャンバースライドにJurkat懸濁液を添加する前に、すべての顕微鏡設定と補体(アンビエント細胞培養チャンバーなど)を準備する必要があります。以下の手順は、市販の顕微鏡(Table of Materials)についての説明です。ただし、細胞培養インキュベーターを備えた倒立型蛍光顕微鏡であれば、いずれでも使用できます。
   1. 偏光トラフィックをイメージングする場合は、60倍の油浸と高い開口数を備えた顕微鏡を使用してください。
   2. オートフォーカスシステムのスイッチがオンになっていることを確認し、オフセットを調整して、底面に結合したRaji細胞に焦点を合わせます。図1を参照してください。
2. ステップ5.3で接着したRaji細胞を含む各ウェルにJurkatを添加した後、予熱された(1-2時間)顕微鏡ステージインキュベーター(すなわち、OKOlab)上のマイクロウェルチャンバースライドを迅速に特定し、顕微鏡でいくつかのXY位置を選択します。この領域では、例えば、Jurkatトランスフェクションされた細胞が顕微鏡の焦点に落ちることによってなされる新たなIS形成を記録する可能性があります。
3. 温度安定化されたステージは安定したX、Y、Z位置を維持することが観察されたため、予熱された顕微鏡ステージインキュベーターを使用してください。便利なXYフィールドの基準は、焦点が合った非コンフルエントなRaji細胞(すなわち、細胞間のギャップを示す)とトランスフェクトされたJurkat細胞の存在(これは透過率とUVまたはGFPチャネルを組み合わせることによって確認できる)です。Jurkat細胞はチャンバースライド上を非常に速く(数分)沈降し、出現するシナプスを画像化する可能性は時間とともに減少します(図1)。定義されたタイムラプス後に実験を終了するか、ステップ7に進んでコンジュゲートを固定し、その後の免疫蛍光および分析を行うことは可能です
   注:最大4つの異なるマイクロウェルから最大16の異なる顕微鏡フィールドを選択して、適切な時間分解能(フレームあたり1〜2分)で同時のマルチウェルタイムラプス取得を行うことができます。この制限は、画像化される多様な蛍光色素の数と強度(カメラの露出に影響を与える)の両方に依存します(CMAC以外の、発現する蛍光タンパク質の数に依存)。フレームレートを上げる方法の1つは、GFPの各「n」時間フレームのうち1つだけでCMACチャネルを記録することです(つまり、図2に示すようにn = 8)Raji細胞はウェル底に付着しており、Jurkat細胞として容易に移動しないためです。さらに、頻繁な紫外線への曝露は細胞を損傷する可能性があるため、これは細胞の生存率に有益です。MVBの偏光が完了するまでに数分から数時間かかるため、タイムフレームレートを1分以下(つまり、フレームあたり20秒、図2)に調整してみてください。このマルチチャンネルキャプチャを実行するには、電動落射蛍光タレットと適切なバンドパス蛍光フィルターまたは同等のものを備えた顕微鏡が必要です。

結果

図1は、プロトコール(ステップ5.2)に従って得られたシナプスJurkat-Rajiコンジュゲートを表しています。この画像は、代表的なタイムラプス実験の最初のフレームを表しています。2 x 10⁵ Raji細胞および2 x 10⁵ Jurkat細胞を1 cm²ウェルに添加した。上のパネルは透過率チャネルを示し、中央のパネルはCMAC(青)チャネル(Rajiセル)で構成され、下のパネルは透過率とCMACマージチャネルの両方を示しています。黄色の矢印は、いくつかのシナプス抱合体を参照としてラベル付けし、緑の矢印は、1つのJurkat細胞といくつかのRaji細胞(複合抱合体)によって作られたシナプス抱合体を示しています。細胞濃度の低下(1cm²ウェル中の10⁵個以下の細胞)は、複雑な細胞コンジ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カメラ ニコン DS-QI1MC	ニコン	MQA11550	冷却カメラヘッド
CMACの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C2110	セルトラッカーブルー
JURKAT細胞	ATCCの	ATCC TIB-152	エフェクターTリンパ球
μ-Slide 8 well ibiTreat、μ-Slide 8 well Glass-Bottom	イビーディ	Cat.No:80826、80827	細胞培養および細胞イメージングサポート
マイクロスコープ ニコン エクリプス Ti-E	ニコン	ニコン エクリプス Ti-E	パーフェクトフォーカスシステム(PFS)オプションを装備した広視野蛍光全電動顕微鏡
顕微鏡ステージインキュベーター、3チャンネル手動ガスミキサーとガスバブラー/湿度モジュール付き	オコラボ	H201-ニコン-TIM-S-ER	細胞培養雰囲気
ラジセル	ATCCの	ATCC CCL-86	APCの
RPMIミディアム GIBCO	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21875034	培地
連鎖球菌エンテロトキシンE(SEE)	トクシンテクノロジー株式会社	EP404	細菌毒素
ソフトウェアイメージJ	NIHの	画像J	画像ソフト
ソフトウェア ニコン NIS-AR	ニコン	NIS-Elements AR	画像キャプチャおよび分析ソフトウェア