フローサイトメトリーによるヒトサイトカイン誘導キラー細胞のCDマーカー認識

要約

出典:Hsiao, C. H., et al.がん治療のための細胞傷害性サイトカイン誘導キラーT細胞の単離と増殖。J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオでは、末梢血単核細胞培養から増殖したサイトカイン誘導キラーT細胞(CIK細胞)の割合を決定するフローサイトメトリーベースの手法を実演しています。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. CIKの誘導と拡張

1. 0日目に、PBMC(1 x 10⁶)を1,000 IU/mLのIFN-γを含む新鮮な基礎培地で、加湿細胞培養インキュベーターで37°C、5%_CO2で24時間培養します。
2. 1日目に、50 ng/mLの抗CD3抗体、1 ng/mLのrh IL-1α、および1,000 U/mLのrh IL-2を含む新鮮な基礎培地で培地をリフレッシュします。3日ごとにミディアムをリフレッシュしてください。
3. 7日目に、1,000 U/mLのrh IL-2を含む新鮮な基礎培地で培地をリフレッシュします。細胞増殖が終了するまで、3日ごとに培地をリフレッシュします(14日目)。

2. CIK細胞評価のための免疫表現型検査

1. CIK細胞を10 mLの滅菌PBSで洗浄します。300 x gおよび18-20°Cで10分間遠心分離し、上清を吸引し、10 mLのPBSで細胞を再懸濁します。細胞数をカウントし、トリパンブルー排除アッセイを使用して細胞生存率をテストします。
2. CIK細胞を6本の滅菌済み1.5 mLチューブに分注し、密度は~5–10 x 10⁵細胞/mL PBSです。ラベルを貼り、次のように扱います:チューブ1、ブランク(抗体なし);チューブ2に、アイソタイプIgG1-FITCを20 μL加えます。チューブ3に、アイソタイプIgG1-APC mAbを20 μL加えます。チューブ4に、20μLのCD3-FITCを加えます。チューブ5に20 μLのCD56-APC mAbを添加します。チューブ6に20 μLのCD3-FITCと20 μLのCD56-APC mAbを添加します。
3. 1 mLの滅菌ピペットでCIK細胞を少なくとも3回ピペッティングして抗体と静かに混合し、暗所で室温で30分間インキュベー
トします。
4. チューブを300 x gおよび18-20°Cで10分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLのPBSで1回懸濁します。1mLの滅菌ピペットで少なくとも3回、ゆっくりと上下させます。
5. 手順2.4を繰り返します。
6. フローサイトメトリー解析の前に、チューブを暗闇に置いておきます。

>3. CDマーカー認識

1. 細胞懸濁液を、細胞ストレーナーキャップ(100 μmメッシュ)付きの滅菌済み5 mLポリスチレン丸底チューブに移し、キャップを静かにピペッティングします。チューブをカルーセルに順番に置きます。
2. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを開き、実験フォルダを作成します。New Specimen ボタンをクリックして、試験片とチューブを実験に追加し、チューブに次のように名前を付けます。チューブ2、アイソタイプIgG1-CD3;チューブ3、アイソタイプIgG1-CD56;チューブ4、CD3;チューブ5、CD56;チューブ6、CD3CD56。
3. CIK細胞集団の散布図ゲーティングシステムを作成します(図1A)。
   1. Tube 1 (Blank)を選択し、Dot PlotボタンをクリックしてFSC-A/SSC-Aプロットを作成します。FSC-Aしきい値>5 x 10⁴で細胞集団全体に長方形のゲートを描き、細胞破片を除外します。
   2. 新しいドットプロットのSSC-A/SSC-Hパラメータを選択し、すべての単一セルの周囲にポリゴンゲートを描画します。新しいヒストグラムプロットのCount/FITC (CD3)パラメータとCount/APC (CD56)パラメータをそれぞれ選択します。新しいドットプロットのFITC (CD3)/APC (CD56)パラメータを選択し、4つの部分母集団を定義するための4象限ゲートを描画します。
   3. 各検体の20,000個の単一細胞からのデータを記録します。Load Sampleボタンをクリックして、最初にブランクコントロールサンプルを分析します。CD56およびCD3チャネルパラメータを使用して、CIK細胞集団全体を同定します。
4. すべての標本の調査について、手順3.3を繰り返します。
5. 個々の検体の統計値を含むファイルを開き、CIK細胞集団を解析し、解析ファイルに再印刷します。

結果

図1:代表的なPBMCサンプルからのCD3⁺CD56⁺ T細胞の割合。(A)リンパ球は、特定のサイズと粒度によって認識されました。フローサイトメトリーによる解析のために選択された単一細胞集団。(B)健常ドナー3名によるCIK拡大効果の統計解析をt検定(*, p < 0.01)を用いて

行いました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
APCマウス抗ヒトCD56抗体	BDの	555518	B159
APCマウスIgG1、κアイソタイプコントロール	BDの	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II フローサイトメーター	BDの	338962	SN:R33896202856
ダルベッコ モディファイドイーグル ミディアム/F12	ハイクローン	02 SH30023	OC-3細胞培養用基礎培地
ウシ胎児血清	ハイクローン	03 SH30084月	K562およびOC-3細胞培養用。完全な培地にはFBSが10%含まれています
フィコール・パケ・プラス	GEヘルスケアライフサイエンス	71101700 - EK	密度勾配ソリューション
FITCマウス抗ヒトCD3抗体	BDの	555332	UCHT1
FITCマウスIgG1、κアイソタイプコントロール	BDの	555748	MOPC-21
ヒト抗CD3 mAb	タカラ	T210	OKT3 2.5 mLのストック(1 mg / 1 mL)を50 mLの誘導培地に加えます。.-80°Cでの保管ストック
RPMI1640ミディアム	ギブコ	11875-085	K562細胞培養用の基礎培地。4°Cでの保管ストック

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