マウスリンパ器官におけるインターフェロン-ガンマ分泌物の同定のためのアッセイ

要約

出典:Mazet, J. M., et al.リステリア菌感染後のマウス脾臓におけるIn Situインターフェロンガンマ産生のイメージング。 J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、マウスの脾臓におけるin situインターフェロンガンマ(IFN-γ)分泌物を可視化するイメージング法を示しています。細菌感染とT細胞およびナチュラルキラー細胞内でのIFN-γ蓄積の誘導に続いて、マウスから脾臓を採取します。組織切片を取得したら、免疫染色を行い、細胞内のIFN-γを可視化します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウスにおける抗原特異的CD8+ T細胞の養子導入

1. T細胞受容体トランスジェニックマウスのリンパ節懸濁液から、緑色蛍光タンパク質(OTI-GFP)または赤色蛍光タンパク質(OTI-RFP)を発現するオボアルブミン(OVA)特異的CD8⁺ T細胞(OTI)を、製造手順に従ってマウスCD8⁺ T細胞単離キットを使用して単離します。前述したように、シリンジプランジャーを使用してリンパ節を粉砕することにより、細胞懸濁液を調製します。
2. Cahalanらが記載した静脈内注射により、OTI-GFPまたはOTI-RFP細胞(3×10⁶細胞)をC57BL/6野生型マウスレシピエントに移す。通常6〜12週齢のマウスを使用する
   手記： このステップはオプションであり、抗原特異的CD8⁺ T細胞の追跡にのみ必要です。

2. リステリア菌感染症

1. 卵子を発現するように遺伝子組み換えされたL.モノサイトゲネス(LM-OVA)を、OD600が前述のように0.08〜0.1に達するまで、穏やかな攪拌下下で37°Cのブロス心臓注入で指数関数的に成長する段階に拡大します。
2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した0.1–0.5 LD50 LM-OVAを100 μL (最大容量 = 200 μL) を、29 Gインスリン注射器を使用した静脈内注射により、必要に応じてOTI-GFPまたはOTI-RFP細胞を持つC57BL/6野生型マウスレシピエントに注入します。
   手記：私たちの手では、0.1 x LD50 LM-OVAは2 x 10⁴コロニー形成単位(CFU)に相当します。OVAを発現するように遺伝子改変されたL. monocytogenesは、以前に転写されたOTI CD8⁺ T細胞を活性化するために使用されますが、L. monocytogenesの他の株を使用することもできます。

3. サイトカイン分泌をブロックするためのブレフェルジンA(BFA)による治療

1. 29Gインスリン注射器を使用してマウス犠牲になる前に、200μLのPBSに250μgのBFAを腹腔内6時間注入します
   手記： 凍結乾燥されたBFAは、最初にジメチルスルホキシド(DMSO)に再懸濁され、25 mg/mLの濃度のストックを調製します。次に、BFAを室温(RT)のPBSで希釈して、注入前に結晶化しないようにします。サイトカイン分泌の阻害は、細胞内のIFNγの蓄積を誘導します。これは、サイトカインの検出に不可欠です。

4. 脾臓の収穫

1. CO₂の濃度が上昇し、続いて子宮頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させます.
   手記： マウスの人道的な安楽死に関する地元の機関のガイドラインに従ってください。
2. 腹部を70%エタノールで洗浄し、はさみで切開して、脾臓が位置するマウスの左側側面の皮膚に1〜2 cmの切り込みを入れます。腹膜を慎重に切開して脾臓を露出させ、ピンセットで取り出します。脾臓の構造を乱さないように、鉗子で絞ったり切ったりしないように注意しながら、脾
臓を収穫します。

5. パラホルムアルデヒド(PFA)による脾臓の固定

1. 3.75 mLのPBSと3.75 mLの0.2 M L-リジンを混合して、固定液を調製します。21 mgのm-過ヨウ素酸ナトリウムを加え、よく混ぜます。次に、2.5 mLの4% PFAと20 μLの12 N NaOH.
   を加えます 手記：同じ日に固定液を使用し、余分なものは廃棄します。.保管しないでください。この固定ステップは、サンプルにGFPなどの蛍光タンパク質が含まれている場合に重要です。微量のメタノールを含むPFAは、蛍光タンパク質を変性させるため、使用しないでください
   注意： PFAは有毒であり、取り扱いには注意が必要です。
2. 脾臓を固定液に浸し、穏やかに攪拌しながら最低4時間、通常は4°Cで16〜20時間固定します。
3. 固定液を廃棄し、5 mLのPBSをRTで5分間、穏やかに攪拌しながら加えます。
4. PBSを5 mLの新鮮なPBSと交換し、穏やかに撹拌しながら4°Cで1時間インキュベートします。
5. PBSを5 mLの30%スクロースと交換し、12〜24時間
   インキュベートします。 手記：この方法は、組織の形態を維持するのに役立ちます。ショ糖溶液とインキュベートした後、臓器は井戸の底に沈むはずです。

6. 凍結とセクショニング

1. 大きなレセプタクルにドライアイスを入れ、中に約50mLの純粋なメタノールと数個のドライアイスが入った小さなレセプタクルを入れます。
2. 糸くずの出ないワイプで脾臓をやさしく乾かします。
3. 脾臓を、底部に最適な切断温度(OCT)コンパウンドの滴を含むベースモールドの中に置きます。気泡が出ないように注意してください。脾臓にOCTを追加します。
4. 鉗子を使用して、メタノールの表面にベースモールドを堆積させ、OCTに触れないようにします。
5. 凍結したら切片化を進めます.
   手記：凍結した脾臓は-80°Cで数ヶ月間保管することができます。
6. クライオミクロトームを使用して組織を切片化します。
   1. クライオスタットのチャンバー温度を-21°Cに設定し、希望の厚さ(通常は約10μm)の切片を切断します。このプロトコルは、最大30μmの厚さで動作します。
7. ガラス顕微鏡スライド(材料の表を参照)に切片を収集し、目視で検査します.
   手記：切片は-80°Cで数ヶ月間保持できます。

7. 免疫蛍光染色

1. セクションがRTに来るのを待ちます。
2. ティッシュ切片の周りに液体ブロッカー(PAPペンなど)で円を描きます。OCTの外側に描画しないと、くっつきません。
3. 乾燥したら、PBSを組織切片に5分間置いてサンプルを再水和します.
   手記： セクションに付けられるボリュームは、セクションのサイズによって異なります。通常、100〜300μLを使用します。再水和した後は、セクションを乾かさないでください。
4. PBSで少なくとも2回すすいで、セクションがスライドにしっかりと接着していることを確認します。
5. ブロッキング溶液を切片に追加して、抗体の非特異的結合を減らします。
   1. ブロッキング溶液を次のように調製します:0.1% Triton X100、2% ウシ胎児血清(FCS)、2.5 μg/mL Fc受容体遮断薬(抗マウスCD16/32)を含むPBS。次に、染色パネルの各二次抗体の種の2〜5%正常血清を添加します.
      手記：抗体が直接標識/ビオチン化されている場合は、各一次抗体の種の5%正常血清を添加してください。一次抗体と二次抗体の1つが同じ種由来の場合(例:ウサギで産生された一次抗体と二次ウサギ抗ラット抗体)、バックグラウンドシグナルが増加するため、正常な血清種を使用しないでください。
   2. 吸引によりPBSを切片から静かに除去し、サンプル切片ごとに100μLのブロッキング溶液を加えます。蓋付きの湿ったチャンバーでRTで最低1時間インキュベートします。
6. 一次抗体で染色します。
   1. 一次抗体をブロッキング溶液中で最適な濃度に希釈します。一般的な開始点の抗体濃度は5 μg/mLですが、各抗体および組織ごとに最適化する必要があります
      手記：抗体が直接標識されている場合は、抗体混合物を17.135 x g(13.500 rpm)で4°Cで15分間遠心分離してから使用してください。蛍光色素は沈殿する可能性があります。このステップにより、沈殿物がペレット化され、沈殿した抗体がスライド上に非特異的に沈着するのを防ぎます。
   2. ブロッキング溶液を各サンプルの一次抗体ミックスに置き換えてください。
   3. 室温で4時間インキュベートするか、蓋付きの湿ったチャンバーで4°Cで一晩(OVN)インキュベートします。
7. 洗濯を行ってください。
   1. PBSに2% FCSを添加して、Wash Bufferを調製します。
   2. 洗浄バッファーで4回洗浄します:1回はクイック(インキュベーションなし)、1回は10分間、2回は5分間です。その後、PBSで5分間最終洗浄を行います。
8. 二次抗体による染色。
   1. 目的の二次抗体をブロッキング溶液中で最適な濃度で希釈します。一次抗体について説明したように、混合物を遠心分離します。
   2. 最終的な洗浄液を取り出します。切片の上に二次抗体ミックスを添加し、蓋付きのウェットチャンバー内でRTで1〜4時間インキュベートします。
9. 洗浄バッファーで4回洗浄します:1回はクイック(インキュベーションなし)、1回は10分間、2回は5分間です。その後、PBSで5分間最終洗浄を行います。
10. 最終的な洗浄液を取り出します。PBSを蒸発させますが、セクションを過度に乾燥させないでください。サンプルの上に封入剤を一滴垂らし、その上にカバーガラスを慎重に置きます。封入剤はセクション全体を回復する必要があります。光から保護されたRTでポリメラーゼOVNを
    手記：スライド裏面の部分の周囲に円を描き、封入剤を塗布してください。封入剤を塗布すると、組織が見づらくなる場合があります。
11. スライドは、イメージングの準備ができるまで、4°Cの暗所で保管します。

8. イメージングと解析

1. 共焦点顕微鏡で染色のイメージングを行います.
   手記：このプロトコルでは、倒立型スペクトルレーザー走査型顕微鏡(材料表を参照)と対物レンズ10x/NA 0.40または60x/NA 1.4(サイトカイン細胞内局在の分析用)を使用しました。励起波長と蛍光波長は、各蛍光色素分子と蛍光タンパク質について材料表に示されています。
2. 必要に応じて、画像処理ソフトウェア(イマリスやフィジーなど)を使用して分析と定量化を行います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ブレフェルディンA	ケンブリッジバイオサイエンス	CAY11861
パラホルムアルデヒド	寒天科学	R1018
L-リシン二塩酸塩	シグマライフサイエンス	L5751
メタ過ヨウ素酸ナトリウム	サーモサイエンティフィック	20504
D(+)-サッカロース	VWRケミカルズ	27480.294
精密ワイプ紙キムテック科学	キンバリー・クラーク・プロフェッショナル	75512
O.C.T.コンパウンド、クライオトミー用封入剤	VWRケミカルズ	361603Eメール
Fcブロック、精製抗マウスCD16/32、クローン93	バイオレジェンド	101302	抗体クローンと使用濃度:2.5 mg/ml
顕微鏡スライド - Superfrost Plus	VWRケミカルズ	〒631-0108
アンチCD169 - AF647	バイオレジェンド	142407	抗体クローンおよび使用濃度:クローン 3D6.112 1.6 mg/ml
			励起波長:650
			発光波長:65
対F4/80 - APC	バイオレジェンド	123115	抗体クローンおよび使用濃度:クローンBM8 2.5 mg/ml
			励起波長:650
			発光波長:660
アンチB220 - PB	バイオレジェンド	103230	抗体クローンおよび使用濃度:クローンRA3-6B2 1.6 mg/ml
			励起波長:410
			発光波長:455
抗IFNg - ビオチン	バイオレジェンド	505804	抗体クローンと使用濃度:クローンXMG1.2 5 mg / ml
アンチIFNg - BV421	バイオレジェンド	505829	抗体クローンと使用濃度:クローンXMG1.2 5 mg / ml
			励起波長:405
			発光波長:436
反Nkp46/NCRI	R&Dシステム	AF2225	抗体クローンおよび使用濃度:ヤギ 2.5 mg/ml
反ヤギIgG-FITC	ノヴスビオ	NP番号 1-74814	抗体クローンと使用濃度:1 mg/ml
			励起波長:490
			発光波長:525
ストレプトアビジン - PE	バイオレジェンド	405203	抗体クローンと使用濃度:2.5 mg/ml
			励起波長:565
			発光波長:578
ストレプトアビジン - FITC	バイオレジェンド	405201	抗体クローンと使用濃度:2.5 mg/ml
			励起波長:490
			発光波長:525
フルオロマウントG	サザンバイオテクノロジー	0100-01
カバーグラス22x40mm	メンゼル・グレイザー	12352128
リキッドブロッカー スーパーパップ ペンミニ	アクソラ	キャッシーダイパップS-M
Imaris - 顕微鏡画像解析ソフトウェア	ビットプレーン
共焦点顕微鏡 - Olympus FV1200 Laser scanning microscope	オリンポス
クライオスタット - CM 1900 UV	ライカ
ベースモールド使い捨て	フィッシャーサイエンティフィックUKリミテッド	11670990
PBSの1X	ライフテクノロジーズ株式会社	20012068
BHIブロス	VWRブランド	303415ZA
GFPの			励起波長:484
			発光波長:507
RFPの			励起波長:558
			発光波長:583
インスリン注射器 針付き 29G	VWRインターナショナル	BDAM324824
C57BL/6 野生型マウス	チャールズ川