マウス全血からの血小板の精製と活性化

要約

出典:Narciso, M. G., et al.マウスの血液からの血小板の精製。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、マウスの全血から血小板を精製し、その後の血小板アゴニストトロンビンによる活性化のプロトコルについて説明します。フローサイトメトリーで解析すると、精製された休止血小板は、その細胞表面マーカーCD41の発現に基づいて特徴付けられるのに対し、精製された活性化血小板は、表面マーカーCD41とCD62Pの両方を共発現します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 血小板の浄化

>注:血小板の精製は、その分解を防ぐために室温で実施する必要があります。試薬と機器の温度が18〜22°Cであることを確認してください。血小板の劣化を防ぐために、手順中は迅速なピペッティングや激しい振とうを避ける必要があります。

1. 600 μL のイオヘキソールグラジエント培地 (12% イオヘキソール粉末、0.85% 塩化ナトリウム、5 mM トリシン、pH 7.2) を 1.5 mL チューブに加えます。
血液
2. とイオヘキソール培地が混ざらないように、ピペットチップの幅広のピペットチップを備えたグラジエント培地の上に、チューブの側面に200μLの血液サンプルをゆっくりと加えます(図1A)。
3. サンプルを含むチューブを400 x gで20分間、20°Cで、ゆっくりと加速および減速しながらスイングバケットローターで遠心分離します。
4. RBC層とWBC層を乱さずに、ワイドボアピペットチップを使用して、多血小板層の大部分と少数血小板層(合計300〜400μL)を収集します(図1B)。血小板サンプルを新しいチューブに移します.
   手記：血液中の血小板数が少ない場合、または血液の使用量が少ない場合、多血小板層と低血小板層は1つの層と見なすことができます。
5. PBS1 mLを血小板サンプルに加え、反転させて混合し、スイングバケットローターで800 x g、20°Cで10分間遠心分離します。溶液を完全に廃棄し、200 μLのPBSを加えて、マイルドピペッティングで血小板を再懸濁します
   手記： このステップは、グラジエント培地と血漿タンパク質を除去し、トロンビンなどのアゴニストに対する血小板の感受性を高めるため、オプションです。遠心分離機が異なればプログラムも異なるため、遠心分離機のユーザーマニュアルを読むことで、遅い加速/減速を判断できます。
6. このサンプルの30μLを新しいチューブに移し、血小板をカウントします。残りの血小板は、血小板の活性化、凝集、顆粒放出などの生化学的および生理学的アッセイに使用できます。
7. RNAまたはタンパク質の抽出では、血小板サンプルを800 x gで10分間遠心分離し、血小板をペレット化します。ペレットを乱さずに上澄みを完全に捨てます。必要な量のRNAまたはタンパク質溶解バッファーを添加して、血小板を溶解します。

2. 血小板活性化

1. チューブ内で、100 μLまでの染色バッファー(PBSと2%ウシ胎児血清、FBS)に100万から200万の精製血小板を加えます。
2. 複数のサンプルについて、1 μL(0.5 mg/mL)で抗体のマスターミックスを1 μL(0.5 mg/mL)で作製し、PE-Cy7ラット抗マウスTER 119、PEラット抗マウスCD45、FITCラット抗マウスCD41、およびAPCラット抗マウス/ヒトCD62P(P-セレクチン)をそれぞれ検出し、それぞれRBC、WBC、血小板、および活性化血小板を検出します。細胞を染色するために、マスターミックスをチューブに加えます。トロンビンは追加しないでください。
3. 別のチューブで、最大100 μLの染色バッファーと0.4 mM GPRPペプチドに100万から200万の精製血小板を加えます。トロンビンを添加して血小板を活性化し、ステップ2.2.
   に従って細胞を染色します 手記：血小板の活性化による凝集体または血栓の形成を防ぐために、トロンビンを添加する前にGPRPをサンプルに添加する必要があります。トロンビン濃度は、血小板の良好な活性化を得るために最適化する必要があります。.血小板の活性化後、フローサイトメトリーによるサンプルの取り込み中にイベントカウントが減少します。
4. ポジティブコントロールとして、チューブ内の最大100 μLの染色バッファーに1 μLの全血と0.4 mM GPRPペプチドを加えます。トロンビンを追加して血小板を活性化します。ネガティブコントロールとして、最大100 μLの染色バッファーに1 μLの全血を加えます。ネガティブコントロールサンプルにトロンビンを添加しないでください。ステップ2.2に従って細胞を染色します。
5. フローサイトメトリーアイソタイプコントロールのために、未染色のPE-Cy7、PE、FITC、およびAPCで5本のチューブを標識します。標識チューブに100 μLの染色バッファー、1 μLの血液、および1 μLの抗体を添加して、細胞を染色します。
6. サンプルをインキュベートして、暗所で室温で30分間染色します。
7. 各チューブに1 mLの染色バッファーを加えてサンプルを洗浄します。800 x gで室温で5分間遠心分離します。ペレットを剥がさずに、染色バッファーを慎重に廃棄してください。
8. 各チューブに300 μLの染色バッファーを加え、穏やかに混合し、FACSチューブに移します。染色したサンプルは、フローサイトメーターで分析するまで暗所で保管してください。

結果

図 1.Iohexol gradient mediumによる遠心分離前後のマウス血液。(A)血液サンプルを慎重に添加すると、遠心分離前にイオヘキソールと血液が2つの別々の層を形成します。左のパネルは概略図、右のパネルは実際のイメージです。(B)全血をグラジエント培地で遠心分離した後、4つの別々の層が見られます。左のパネルはレイヤーの概略図を示し、右のパネルは実際の画像を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
APCラット抗マウス/ヒトCD62P (P-セレクチン)	サーモサイエンティフィック	〒17-0626-82	血小板活性化マーカー
エッペンドルフチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-222-166	遠心分離機用チューブ
ウシ胎児血清(FBS)	インビトゲン	26140079	染色緩衝液用成分
FITCラット抗マウスCD41	BDバイオサイエンス	553848	血小板マーカー
グリプロアルグプロ(GPRP)	EMDミリポア	03-34-0001	血小板血栓の形成を防ぐ
ピペットチップ 1000 μL、ワイドボア	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21-236-2C	血液および血小板サンプルの移送
PEラット抗マウスCD45	BDバイオサイエンス	561087	WBCマーカー
PE-Cy7ラット抗マウスTER 119	BDバイオサイエンス	557853	RBCマーカー
ピペットチップ 200 μL、ワイドボア	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21-236-1A	血液および血小板サンプルの移送
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14040-117	洗浄および希釈用バッファー
染色バッファー	社内	カタログ以外のアイテム	洗浄および希釈バッファー
トロンビン	酵素研究所	HT 1002a	血小板活性化アゴニスト
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S7653	生理食塩水
テーブルトップ遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75253839/433607	スイングバケットローター遠心分離機
トリシン	シグマ・アルドリッチ	T0377	Nycodenz媒体用バッファー
FACSチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	352008	フローサイトメトリー用チューブ

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