ヒト末梢血単核細胞からのCD4+ Vδ1+ γδ T細胞の選択的単離

要約

出典:Welker, C., et al.Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1⁺CD4⁺γδ T cell Progenitor, an Extrathymic αβT cell Progenitor. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)からのCD4⁺Vδ1⁺γδT細胞の低濃度集団の磁気標識ベースの単離のためのプロトコルを示しています。FITC標識抗Vδ1抗体、磁気抗FITCマイクロビーズ、および抗CD4抗体被覆超常磁性ビーズの組み合わせを使用して、CD4⁺Vδ1⁺ T細胞をPBMC集団から成功裏に精製することができます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. Vδ1 T細胞の単離

1. Vδ1 CD4 T細胞の頻度を決定する最初のFACSのために<1 x 10⁶単離リンパ球を採取します><。 手記：このT細胞実体の集団サイズは、個人間および免疫学的状態によって大きく異なる可能性があります。典型的には、T細胞の約1%がVδ1⁺であり、Vδ1⁺細胞の約1〜5%がCD4⁺である。
   1. 2% FCSと5 mM EDTAを含むPBSからなる1 mLのFACSバッファーで細胞を希釈します。660 x gで2分間遠心分離し、上清をデカントします。約100μlのFACSバッファーの還流量は、その後の染色に十分です。細胞を短時間ボルテックスし、5 μl Fcブロッキング試薬と室温で5分間インキュベートすると、FACS染色の特異性が向上します。
   2. Fcブロッキング試薬を除去せずに、ヒトモノクローナル抗体を細胞に直接添加します。Vδ1(1:50)、CD3(1:50)、CD4(1:200)、CD8(1:200)、およびTCRαβ(1:25)に対する抗体で細胞を染色してください。対応する免疫グロブリンアイソタイプでアイソタイプコントロールを調製します。暗所で細胞を抗体と4°Cで20分間インキュベー
   トします。
   3. 細胞を1 mLのFACSバッファーで洗浄し(2分間遠心分離、660 x g)、上清をデカントし、残りのバッファー容量でFACS取得に進みます。
2. FACS分析で使用されていない細胞を12分間、300gで8°Cで遠心分離してペレット化します。上清を除去し、細胞ペレットを1 x 10⁷細胞あたり60 μl MACSバッファーに再懸濁します。1 x 10⁷細胞あたり20 μlのFcブロッキング試薬を加え、4°Cで5分間インキュベートします。
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3. x 10⁷細胞あたり10 μl FITC標識抗ヒトVδ1抗体を細胞に直接添加します。暗所で4°Cで12分間インキュベートします。
4. 14 mLのMACSバッファーを使用して細胞を洗浄します(遠心分離して12分間、300 gで、8°C)。上清を完全に捨て、細胞を1x10⁷細胞あたり80 μl MACSバッファーに再懸濁します。
5. 1-2 x 10⁵細胞を100 μlのFACSバッファーで希釈して、FACS分析による標識の検証を行います。このステップでは、これ以上の添加物は必要ありません。Vδ1^-セルとVδ1⁺セルの明るさに十分な差があることを確認してください。そうでない場合は、手順 1.3 と 1.4 を繰り返します。
6. 1 x 10⁷細胞あたり20 μlの抗FITCマイクロビーズを残りの細胞に加え、よく混合し、暗所4°Cで15分間インキュベートします。その後、少なくとも10 mLのMACSバッファーを使用して細胞を洗浄します(300 x g、8°Cで12分間遠心分離します)。
7. 遠心分離中に、500 μl MACSバッファーで磁石に入れた予冷済み磁気カラムを平衡化します。
8. 細胞を500 μl MACSバッファーに再懸濁し(細胞数が1 x 10⁸より大きい場合は、それに応じてこの容量をスケールアップします)、細胞をカラムに慎重に塗布します。Vδ1^-セルを含むフロースルーを収集します。
9. カラムを500 μl MACSバッファーで3回洗浄し、フロースルーを同じチューブに再度回収します。カラムにバッファーを適用する前に、リザーバーを空にする必要があることに注意してください。
10. カラムを磁気装置から取り外し、15 mLの円錐管に入れます。プランジャーをカラムにしっかりと押し込み、1 mLのMACSバッファーでカラムをすばやくフラッシュします。溶出液をチューブに集めます.
    注:>98%の純度を得るためには、通常、2番目のカラムでステップ1.7〜1.9を繰り返す必要があります。
11. 従来と同じ抗体パネル(1.1.2参照)を用いたFACS解析により細胞の純度を確認し、細胞をカウントします。

2. Vδ1CD4⁺ T細胞の単離

1. CD4ビーズ25μlをボルテックスで>30秒間再懸濁します。1.5 mLの反応チューブに1 mLのMACSバッファーを入れたビーズ(メーカーが示す最小量)を洗浄し、チューブを磁石に1分間入れて洗浄します。上清を小型ピペット(200 μl)で慎重に廃棄し、ビーズを元の容量のMACSバッファーに再懸濁します。
2. Vδ1⁺細胞をペレット化(12分間遠心分離、300 x g)し、上清を吸引し、すべてのVδ1⁺細胞を500 μl MACSバッファーに再懸濁し、ビーズを含むチューブに加えます。激しく混合し、4°Cで20分間インキュベートし、一定の傾け方で(ローテーター内など)。
3. 細胞の入ったチューブを磁石に2分間入れ、蓋に残留物がないことを確認します。
   注:CD4⁺細胞は磁気ビーズを結合し、磁石に面したチューブの側面に付着します。
4. チューブを磁気デバイスの内部に保持しながら慎重に蓋を開け、CD4-Vδ1⁺細胞を含む上清を小型ピペットで回収します。^CD4-Vδ1+細胞を別のチューブに入れ、このチューブを再び磁石に入れて、集団からCD4細胞やビーズが残る可能性を防ぎます。
   1. CD4^-細胞を5 mLのMACSバッファーで洗浄し(12分間遠心分離、300 x g)、培地100 μlあたり⁵細胞×10 10の濃度で再懸濁します。CD4^-細胞は、適切な条件下で容易に培養できます。
5. CD4⁺細胞ターゲットを取り付けたチューブを磁場の外側に置き、細胞を500μlのMACSバッファーに再懸濁し、磁気デバイスに戻します。手順2.3〜2.5を2回繰り返して、より高い純度を取得します。ピペッティングで上清を取り除きます。
6. CD4⁺細胞を100 μLの培地(RPMI 1640、10 % FCS、1% L-グルタミン、1% ペニシリン/ストレプトマイシン)に再懸濁し、ビーズ剥離液10 μlを加えます。室温で45分間インキュベートし、一定の傾け方で行います(例:ローテーター内)。
7. 細胞を磁石に1分間置き、ビーズフリーのVδ1⁺CD4⁺細胞を含む上清を小型ピペットで慎重に回収します。
8. 磁石の外側で、ビーズを100 μlの培養培地で再懸濁し、ステップ2.6と2.7を2回繰り返して、CD4⁺細胞の細胞数を増やします。
9. 細胞をペレット化し(300 x gで12分間遠心分離)、ピペッティングで上清を完全に廃棄します。事前に温めた新鮮な培地で細胞を再懸濁し、カウントします。ステップ1.1.1-1.1.3で示されたFACS分析により、Vδ1⁺CD4⁺細胞の純度を調べます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ・アルドリッチ	D8537
MACSバッファ	ミルテニーバイオテック	〒130-091-222	BSAを添加し、使用前に予冷してください
BSAの	ミルテニーバイオテック	〒130-091-376	このサプライヤーからの必須ではありません
対ヒトVd1 FITC(クローン:TS8.2)	サーモサイエンティフィック	TCR2730	このサプライヤーからの必須ではありません
抗ヒトCD3 PerCP(クローン:SK7)	BDバイオサイエンス	345766	このサプライヤーまたはこの蛍光色素から必須ではありません
抗ヒトTCRab PE(クローン:T10B9.1A-31)	BDバイオサイエンス	555548	このサプライヤーまたはこの蛍光色素から必須ではありません
対ヒトCD4 VioBlue(クローン:MT466)	ミルテニーバイオテック	〒130-097-333	このサプライヤーまたはこの蛍光色素から必須ではありません
抗ヒトCD8 APC-H7(クローン:SK1)	BDバイオサイエンス	641400	このサプライヤーまたはこの蛍光色素から必須ではありません
Anti-FITC MultiSortキット	ミルテニーバイオテック	〒130-058-701	抗FITCマイクロビーズよりも優れた結果が得られます
MS カラム	ミルテニーバイオテック	〒130-042-201	使用前に予冷してください
MiniMACSセパレーター	ミルテニーバイオテック	〒130-042-102
CD4ポジティブアイソレーションキット	ライフテクノロジー	11331D