ヒト好中球細胞外トラップを作製するIn Vitro技術

要約

出典:Najmeh, S., et al. 簡略化されたヒト好中球細胞外トラップ(NET)の分離と取り扱い。 J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオは、好中球の細胞外トラップ(NET)を生成および単離するin vitro技術を示しています。好中球は末梢血から単離され、ホルボールミリスチン酸酢酸(PMA)で刺激されてNETが生成されます。インキュベーション中、好中球は細胞死(NETosis)のプロセスを経て、顆粒状の細胞質タンパク質と混合された凝縮解除されたクロマチンからなるNETを放出します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. NETの生成

1. 500 nMのPMA(好中球溶液30 mLあたり)で好中球を刺激し、20 mmメッシュの150 x 25 mmフラット組織培養皿で37°C、5%CO₂で4時間インキュベートします。これにより、NETosisが可能になります。
2. 4時間の刺激後、NETと好中球の層を底に付着させたまま、培地を静かに吸引して廃棄します。このレイヤーを中断しないでください。
3. 皿ごとにCaとMgを含まない合計15mlの冷たいPBSを使用して、皿の底に15mlのPBSをピペッティングして各皿の底を洗い、底からすべての付着物を浮き上がらせます。
4. 各皿を洗浄して得られた溶液(ステップ1.3)を15 mLの円錐管に集め、450 x g、4°Cで10分間遠心分離します。好中球と残りの細胞は底部でペレット状になり、無細胞のNETリッチ上清が残ります。
5. 上清を1.5 mLの微量遠心チューブに分け、18,000 x g、4°Cで10分間遠心します。これにより、すべてのDNAがペレット化されます.
   手記：通常の遠心分離機でそのような高速が達成可能な場合、より大きなチューブでの遠心分離はより簡単で時間もかかりませんが、そうでない場合は、高速マイクロ遠心分離機を使用するために上清を小さなチューブに分割する必要があります。
6. 上清を捨て、氷冷PBSで一緒に得られたすべてのペレットを、PBS100μlあたり2 x 10⁷好中球に対応する濃度に再懸濁します。これにより、その後の実験に使用できる無細胞NETストックが得られます。
7. 分光光度法または別のDNA定量ツールを使用して得られたサンプル中のDNA濃度を測定します。サンプル中の適切な濃度は、140〜180 ng/μlの範囲である必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、変性、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし	ヨーロッパバイソン	311-425-CL
RPMI-1640 L-グルタミン入りミディアム	ヨーロッパバイソン	350-000-CL	3% RPMI溶液は、RPMIに3%ウシ胎児血清を添加して作られ
ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)	シグマ・アルドリッチ	P8139
ウシ胎児血清(FBS)	ヨーロッパバイソン	〒080-150
20mmグリッド(150 x 25mm)のインテグリッド組織培養皿	隼	353025

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