マウスの歯のブロックからの歯肉免疫細胞ネットワークの分離

要約

出典: Dutzan, N. et al., Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、マウスモデルからの歯肉免疫細胞ネットワークの分離手順を示しています。酵素による消化により、付着した歯や骨から歯肉組織が放出され、さらに機械的に消化されて、歯肉から免疫細胞が放出されます。単離された細胞は、免疫学的実験の準備ができています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 事前に準備する

1. 完全な培地を調製する:RPMIに2 mM L-グルタミン、100単位/ mlペニシリン、100 ug / mlストレプトマイシン、および10%FBSを補充しました。
2. DNase培地を調製する:50 mLのRPMI培地に7.5 μgのDNaseを添加します(新鮮にし、常に氷の上に置いてください)。
3. コラゲナーゼ-DNase培地の準備:5 mlのDNase培地と3.2 mg / mlのIV型コラゲナーゼ(新鮮に、常に氷の上に置いてください)。
4. 遠心分離機を4°Cに予冷します。
5. 37°Cに温めるシェーカーインキュベーター。

2. 歯肉ブロックからの単離、解剖、細胞単離

1. 動物研究諮問委員会(ARAC)のガイドラインに従って、マウスを適切なチャンバーで_CO2にさらすことにより、マウスを安楽死させます。
2. 胸腔と腹腔を開いて、心臓と内臓を露出させます。灌流するには、下大静脈を切開し、27Gの針が付いた3mlの注射器を使用して、左心室から3mlのPBSを灌流します。
3. マウスの本体と頭をパッドに固定し、胃を上にして固定します。
4. ハサミで首に向かって唇の各交連を切り取り、下顎骨と首の領域を覆う皮膚を分離し、下にある組織と筋肉を露出させます。下唇を解剖して下顎骨を露出させます。
5. 下顎切歯の間を切って下顎骨の両側を分離し、両側を固定して口腔にアクセスします。
6. 鼻腔から離れた口蓋を視覚化して解剖します。
7. 10枚ブレードを使用して領域を解剖し、上顎および下顎の臼歯領域と周囲の歯肉を含めます(図1)。第 1 大臼歯のすぐ前方、第 3 大臼歯の後方に垂直切開を行い、歯肉 (歯を囲む組織の白いカラー) の境界に水平切開を行います。
8. 上顎ブロックと下顎ブロックを50 mLのコラゲナーゼ/ DNase(氷上に保つ)を入れた50 mLの円錐管に入れます。
9. シェーカーインキュベーターで37°Cで1時間インキュベートし、インキュベーションの最後の5分間に0.5 M EDTAを50 μl加えます。
10. ティッシュが入った50 mLのチューブに5 mLの冷たいDNase培地を加え、穏やかに渦巻いて混合します。
11. 4ブロックのティッシュをシャーレに移し、500 μlのDNase培地で覆います。メスの刃を使用して、組織の各ブロックから歯肉を取り除き、刃を歯肉と歯間領域に向けます。
12. シャーレから組織と培地を、解剖時に使用した以前のDNase培地と同様に、細胞ストレーナー(70μmサイズ)を介して新しい50mlチューブに移します。使用したすべての器具をDNase培地(3〜5 ml)で洗浄し、ろ過します。
13. 滅菌した3mlシリンジのプランジャーを使用して、組織をストレーナーに対してマッシュし、冷たいDNase培地(30〜35ml)でろ過します。
14. 細胞ストレーナーを冷たいDNase培地で洗浄します。
15. 4°C、314 x gで6分間遠心分離します。
16. 上清を捨て、1 mLの完全培地に再懸濁します。
17. 自動セルカウンターを使用して、細胞をカウントします(予想される量は8 x 10⁵から1.2 x 10⁶細胞で、生存率は>80%)。

結果

図1:マウス歯肉の分離。 上顎骨の解剖の境界と、歯肉組織の解剖に使用される孤立した歯肉セグメントを示す図。(B)ブロック解剖のための輪郭を持つマウス上顎骨(大臼歯領域)のセグメント、および孤立したブロック。歯肉組織の輪郭が描かれた上顎大臼歯セグメントのヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E)は、低倍率(C)と高倍率(D)で示されています。オリジナルの倍率を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ファインハサミ	ファインサイエンスツール	14058-11
メスのハンドル#3	ファインサイエンスツール	10003-12
メスブレード#10	ファインサイエンスツール	10010-00	不妊
スプリンター鉗子	インテグラミルテックス	6-304
レギュラーベベル付きニードル	BDメディカル	305109	27G、長さ12.7mm
Monojectシリンジ	コヴィディエン	8881513934	ルアーロックチップ 3mL
PBS、pH 7.4	ライフテクノロジー	〒10010-049	カルシウムとマグネシウムなし
RPMIの1640	ロンザ	12-167階	L-グルタミンなし
ウシ膵臓由来のDNase I	シグマ・アルドリッチ	DN25-1Gの
コラゲナーゼIV型	Gibco(Life technologies製)	17104-019
ウシ胎児血清	ジェミニバイオ製品	100〜106
ゲンタマイシン50mg / ml	品質 生物学的	120-098-661EA
ペン連鎖球菌	Gibco(Life technologies製)	15140-122
L-グルタミン	Gibco(Life technologies製)	〒25030-081
0.5M EDTA pH 8.0	品質 生物学的	351-027-721EA
50 mLチューブ	コーニング	352070	ポリプロピレン、滅菌済み
70 μM セルストレーナー	コーニング	352350
ペトリ皿	コーニング	351029	不妊

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