マウス肺組織サンプル中のマクロファージ細胞外トラップの特性評価

要約

出典:Sharma, R., et al.共焦点顕微鏡を用いたマクロファージ細胞外トラップの可視化。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、マウス肺組織におけるマクロファージ細胞外トラップ(MET)の免疫染色および共焦点顕微鏡法に基づく可視化のためのプロトコールについて説明します。組織に常在するマクロファージは、マクロファージ特異的なF4/80表面糖タンパク質マーカーの発現によって特徴付けられ、METは、METマーカーであるマトリックスメタロプロテイナーゼ9、シトルリン化ヒストンH3、および細胞外クロマチンを標識することによって可視化されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 肺組織サンプル

>注:肺組織のin vivo研究では、関連する曝露後のサンプルを研究してください。この実験に最も関連する曝露は、感染性微生物、特に細菌です。この方法に使用できるマウス系統は、C57BL/6またはBALB/cマウス、10〜12週齢、体重25〜30g、雄です。

1. ケタミン(400 mg / kg)とキシラジン(40 mg / kg)の腹腔内注射により、マウスを安楽死させます。胸腔を開き、外科用鉗子とハサミを使用して肺と心臓を露出させます。
   1. 21ゲージの針を使用して温かいPBSを右心室に注入し、血管から血液を30秒間洗い流し、次に10 mLの2%PLP固定液を30秒間(右心室に)注入します。
   2. 温かいPBS(42°C)を使用して、開いた胸腔を洗浄します。21ゲージの針とサイズに合わせてカットされた0.8mmチューブで気管を挿管し、予熱(42°C)した低融点3%アガロース溶液800μLを注入します。
   3. 編みこみシルク(4.0 USP)で気管を結びます。カニューレの挿入点のすぐ下にある気管の周りに糸を置き、簡単なオーバーハンドノットで固定します。アガロースを固めるには、氷のように冷たいPBSを肺の周りに投与します。ハサミと鈍器解剖の両方を使用して、胸腔からブロックとして肺と心臓を取り出します。各肺を個別に摘出し、2% PLPまたはホルマリンで4°Cで16時間固定します。
   4. 組織切片が作製されるまで、標本を4°CのPBSで保存します。
2. 肺組織サンプルを調製するには、次の手順を使用します。
   1. 肺組織(ステップ1.1で切除)を10%天然緩衝ホルマリンで室温で24時間固定します。75%エタノールに移し、12時間サイクル(75%EtOHで2.5時間、絶対EtOHで3時間、溶媒3Bで3.5時間、パラフィンで3時間)で組織プロセッサーに入れます。
   2. 標準パラフィンに埋め込むと、室温で保存されるホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックが作成されます.
      手記：この段階では、一般的に標準的なスライドのために肺切片を切断するのが便利です。
   3. ミクロトームを使用してFFPE肺切片を4〜5μmの厚さで切断し、荷電したコーティングされたスライドにマウントします。
   4. スライドを取り付けるには、60 mm x 24 mmのカバーガラス(サイズ1.5)に3滴の封入剤を置き、カバーガラスのスライドを反転させ、余分な媒体を押し出します。マニキュアで密閉し、室温で保管してください。

2. 肺組織サンプルの調製/顕微鏡検査

1. FFPE肺組織サンプルのワックスを取り除き、再水和し、抗原賦活化溶液で前処理します。
   1. FFPEスライドを60°Cで60分間オーブン乾燥させます。次に、スライドをキシレン溶液に30分間入れ、室温で5分間70%エタノール溶液に移します。水道水ですすいでください。
   2. 耐熱ラップに入れ、圧力鍋で10 m/mol/L Tris、1 mmol/EDTA pH 9.0で10分間HIER-抗原賦活化を行います。20分間冷却します。水道水でロッカーで5分間2回洗い、次にロッカーのPBSで1回洗います。
   3. 10%チキンセラムを5%BSA/PBS溶液で室温で30分間ブロックします。
2. ティッシュを染色します。
   1. マクロファージのMETsを定義するには、一次抗体(MMP-9、H3Cit、およびF4/80)を1% BSA/PBSに1%BSA/PBSで16時間、1/100希釈で4時間添加します(抗体量に関する具体的な詳細は、材料の表に記載されています)。ロッカーでPBSで5分間2回洗います。
   2. 対応する二次抗体と1% BSA/PBS中で室温で40分間インキュベートすることにより、蛍光検出を達成します。抗体は、(1)ニワトリ抗マウス488(緑)、(2)ニワトリ抗ヤギ594(赤)、および(3)ロバ抗マウス647(遠赤)である。
   3. 切片をPBSで洗浄し、DAPI含有封入剤でクロマチン染色用
   マウントします。
3. 倒立顕微鏡に取り付けられた共焦点レーザー走査ヘッドを使用して蛍光画像を取得します。
   1. 405、488、561、および647nmのレーザーで調製物を励起します。20X 0.1 NAの空気対物レンズと40X 1.0 NAの石油対物レンズを使用して、ラインシーケンシャルのレベリングボタン(2ライン平均化)をクリックして、512 x 512ピクセルの単一平面の画像をキャプチャします。
   2. 分析用のセクションごとに少なくとも10個の視野と各結果のデータを取得します(つまり、コントロール用に10個の高出力視野(HFOV)、各マウス用に10個、刺激されたサンプル用に10個など)。
      手記：フィールド全体の代表的なサンプルを得るために、フィールドを異なるセクションに分割し、異なるサンプルごとに同じマトリックスを使用して視野を選択するマトリックスシステムを使用できます(たとえば、フィールドを9つのセクションに分割し、中心と4つのコーナーから、 HFOVが2回取られます)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス検体:一次抗体
ヤギ抗マウスMMP9	アブカム	AF909	10 UG / ミリリットル
ウサギ抗マウスH3Cit(シトルリンR26)	アブカム	AB5103	10 UG / ミリリットル
ラットアンチマウスF4 / 80	インハウス(ハイブリドーマ)	社内	20 ug/ml
ヒツジ アンチヒューマン アンチHNE/NE	サファイアバイオサイエンス	LS-B4244	25 UG / ミリリットル
マウス対ヒトPADI4/PAD4	アブカム	AB128086	10.1 UG / ミリリットル
スーパーフロストプラススライド	メンゼル	S41104A
ダピ・プロロング・ゴールド	分子プローブ	P36931
二次抗体
チキンアンチラビットAF 488 /	ライフテクノロジー	A-21441
チキンアンチウサギAF 594	ライフテクノロジー	A-21442
チキンアンチヤギAF 594	ライフテクノロジー	A-21468
チキンアンチマウスAF488	ライフテクノロジー	A-21200
ロバ反羊AF594	ライフテクノロジー	A-11018
チキンアンチマウスAF 647	ライフテクノロジー	A-21463
ロバ反羊AF594	ライフテクノロジー	A-11016
アイソタイプ制御
ウサギIgG	社内
マウスIgG1	BDバイオサイエンス	550878
マウスIgG2a	バイオレジェンド	400201
ヒツジIgG	社内
顕微鏡
C1共焦点走査型顕微鏡	ニコン
FV1200 共焦点走査型顕微鏡	オリンポス
ティッシュソース(Tissue source)
メルボルン大学薬理学部のマウス肺組織。
メディア
RPMI(ルプミ)	シグマ・アルドリッチ	R8758
ウシ胎児血清	シグマ・アルドリッチ	F0926
L-グルタミン	シグマ・アルドリッチ	G7513
その他の試薬
パラホルムアルデヒド/過ヨウ素酸塩/リジン(PLP)固定剤	シグマ・アルドリッチ	27387
キシレン	シグマ・アルドリッチ	214736
天然ホルマリン	シグマ・アルドリッチ	42904
パラフィン	シグマ・アルドリッチ	327204
ケタミン	シグマ・アルドリッチ	K2753
アガロース	シグマ・アルドリッチ	A2576の
溶剤3B	ハイケム	2026
カバースリップ12 ml	シグマ・アルドリッチ	S1815
カバースリップ60 x 24 ml	シグマ・アルドリッチ	C6875
マウス
C57ブラック6	モナッシュ動物研究プラットフォーム(MARP)
BALB/c	マープ