自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原アジュバントエマルジョンの調製

要約

出典: Bäckström, B. T. 実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速で簡便な標準化された均質化法。(2022年度)

このビデオは、マウスモデルで実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するための抗原アジュバントエマルジョンを生成する効率的な均質化技術を示しています。このエマルジョンは、水相に自己抗原であるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)を含み、不活化病原菌を含む連続的な油相に囲まれています。エマルジョンは、抗原の持続的な放出を確保し、免疫応答を持続させます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>注:このメソッドの概略的な流れを図1に示します。

1. 材料の準備

>注:すべての試薬を無菌フードで無菌的に調製し、指示された温度で分注して保管します。試薬は、その効果を失うことなく最大2年間保存できます。

1. 以下に説明するように、20 mg / mL結核菌を含むCFAを調製します。.
   1. 100 mgの凍結乾燥結核菌H37RA(材料の表を参照)と5つの3.2 mmスチールビーズを7 mLのチューブ(材料の表を参照)に加えます。ホモジナイザー(材料表を参照)でチューブを最高速度設定(5,000 rpm)で60秒間振とうします。
   2. 5 mLの不完全なフロイントアジュバント(IFA)をチューブに加え、最高速度で60秒間再度振とうします。IFA(現在のCFA社名)で均質化した結核菌のスラリーをピペットで新しいチューブに移し、ビーズを残し、使用するまで4°Cで保存します。
2. MOG_35-55ペプチドの凍結乾燥粉末(材料表を参照)に超純水を加えて、最終ペプチド濃度10 mg/mLを得ます。溶液を0.2μmのフィルターに通して滅菌します。60μLのアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存してください><。 手記： この実験に使用したMOG_35-55ペプチドは、ImmunoGradeの純度(~70%)で、TFA切断され、水に容易に溶解し、C末端アミド(-NH₂)を含んでいるため、in vivoの安定性が向上します。ペプチドアリコートは、解凍と再凍結を2回以上行うことはなく、使用するまで-20°Cで保存しました。

2. CFA/ペプチドエマルジョンの調製

1. 免疫に必要なエマルジョンの量を計算します。この標準プロトコルでは、各マウスは、フロイントのアジュバント(CFA)に分散した50 μgのMOG_35-55ペプチドと300 μgの結核菌を受け取ります。エマルジョンの調製に必要な各試薬(MOG_35-55ペプチド、PBS、CFA、IFA)の量は、Supplemental File 1を使用して計算できます。エマルジョンのわずかな損失を補うために、全試薬のさらに20%が計算に含まれています.
   手記：この研究で使用した市販のエマルジョンキット(材料の表を参照)は、滅菌ポーチにチューブ、スクリューキャップ、およびプランジャーが含まれています。エマルジョンキットの各チューブには最大9.6 mLが保持されるため、40匹のマウス(または1匹あたり100 μLのエマルジョンを使用する場合は80匹)の免疫に十分な8 x 1 mLシリンジを調製できます。
2. スクリューキャップ付きチューブ(市販のエマルジョンキットから)と使用する試薬を氷の上に置きます。
3. ステップ2.1で計算した容量に、PBS、ペプチド、CFA中の結核菌、IFAの順にエマルジョン成分を添加します。
4. キャップを数回締めたり緩めたりして、チューブをしっかりと閉じます。チューブを手で5〜10秒間激しく振って、試薬を事前に混合します。
5. チューブを振とうホモジナイザーに入れ、ロッドで固定します。速度を最高に設定し、時間を 60 秒に設定します。ランが終了したら、チューブを氷の上に3分間置きます。同じ設定でさらに 1 回または 2 回実行します。
6. チューブを300 x gで1分間遠心分離し、閉じ込められた空気を取り除き、エマルジョンを圧縮します。
7. キャップをチューブから取り外し、プランジャーをチューブに挿入し、エマルジョンの上部に達するまでゆっくりと押し下げます。チューブの下部にあるスナップオフクロージャーをひねって取り外します。
8. 注射器(1 mL;材料の表を参照)からプランジャーを取り外します。.注射器に針(できれば25〜27 G)を追加します。.
9. 注入シリンジの後端をチューブ底部の専用ロックに取り付け、短くひねってロックします。
10. プランジャーを優しく押して、エマルジョンをチューブから注射シリンジに移します。エマルジョンが注射シリンジの0.15mL目盛りに達したら停止します。.
11. 注射シリンジをチューブから分離し、シリンジに空気が入らないように注意しながら、プランジャーを慎重に挿入します。エマルジョンが針から出てくるまでプランジャーを押します.
    手記：この時点で、エマルジョンの一部を品質管理に使用できます(ステップ3を参照)。
12. チューブ内に存在する残りのエマルジョンについて、手順2.8〜2.11を繰り返します.
    手記：高価なCFA/抗原エマルジョンの無駄を最小限に抑えるために、1 mLシリンジを使用する必要があります。チューブの底にある専用ロックに適合する他のシリンジを使用することができます。ただし、大量のエマルジョンを調製する必要がある場合があります。CFA/MOG_35-55ペプチドエマルジョンは、EAE誘導能力を失うことなく、4°Cで最大15週間保存できます。

3. エマルジョンの品質管理

1. 落下試験:エマルジョンを少量加え、20mLの冷水で満たされた滅菌済みの50mLコニカルチューブに入れます。チューブを閉じて、手で数秒間振ってください。小さなはっきりとした液滴の出現は、油中水型エマルジョンの形成を確認します。
2. 位相差顕微鏡を用いてエマルジョンを検査します。
   1. 油中水型粒子のサイズを分析するには、顕微鏡スライドにエマルジョンの小さな滴(2〜3μL)を追加し、カバースリップで塗り、円を描くように強く押してエマルジョンを平らにします。
   2. 400倍の倍率で位相差顕微鏡(材料の表を参照)で塗抹されたエマルジョンを調べ、エマルジョンの単層があるフィールドに焦点を合わせます。小さな均一な灰色/白の粒子が見えることを確認します(図2A)。

結果

図1:市販のエマルジョンキットを使用したエマルジョン調製のプロセスの概略図。この図は、許可を得てTopping et alから再利用されています。

図2:さまざまな方法を使用して製造されたエマルジョンの特性評価。(A)標準的な均質化法、従来のシリンジ法、ボルテックス法の3種類の調製方法の代表的な画像。スライドガラス上に少量のエマルジョンを載せ、位相差顕微鏡(400倍)で観察した。スケールバー = 50 μm。>15の実験から得られた各方法の代表的な調製物を示します。平均D(体積加重平均)を粒度分析装置で測定したところ、振とう均質化法で0.7μm、シリンジ法で1.4μm、ボルテックス法で5....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL注射器シリンジ	B.ブラウン	9166017V
1 mL注射器シリンジ	シグマ・アルドリッチ	Z683531
キャップ付き7mlの空のチューブ	ベルタン・インストゥルメンツ	P000944LYSK0A.0	7mLチューブ
50 mL滅菌遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	10788561	50mLチューブ
分散剤、軽質鉱物油	シグマ・アルドリッチ	M8410	RTでストア
エマルジョンキット	ベルタン・インストゥルメンツ	D34200.10 個	チューブ、キャップ、プランジャーが入っています
不完全なフロイントのアジュバント	シグマ・アルドリッチ	F5506	+4°Cで保存
結核菌、H37RA	フィッシャーサイエンティフィック	DF3114-33-8	+4°Cで保存
Minilys-パーソナルホモジナイザー	ベルタン・インストゥルメンツ	P000673-MLYS0-A	振とうホモジナイザー
MOG 35-55 ペプチド	イノベータン	該当なし
モンタニドISA 51 VG	セッピック	36362Z	FDA承認のオイルアジュバント
ポール アクロディスク シリンジ フィルター 0.2 μm	フィッシャーサイエンティフィック	17124381	滅菌フィルター
PBS、Ca2+/Mg2+フリー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190144	PBSの
位相差顕微鏡	オリンポス	BX40-B型
スチールビーズ3.2 mm	フィッシャーサイエンティフィック	NC0445832	オートクレーブ処理とRTでの保管