Gamma Delta上皮内リンパ球の生体内可視化

要約

出典:Jia, L., et al. マウス小腸の上皮内リンパ球の生体内イメージング。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、共焦点顕微鏡を用いたトランスジェニックマウスのγδ上皮内リンパ球(IEL)の可視化を示しています。外科的処置では、穿孔線を作成し、腸粘膜と絨毛を露出させるために縦方向に切開します。トランスジェニックマウスは、レポータータンパク質をγδ IELでのみ発現するため、その追跡が可能になります。生体内イメージングは、腸管上皮細胞の基底膜に沿った緑色蛍光標識γδIELのダイナミックな動きを捉えます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウスの準備

>注:動物の調製と手術を含む次の手順は、30〜40分かかります。手術の前に、顕微鏡の電源を入れ、顕微鏡の密閉されたインキュベーターを37°Cに温めます。

1. Bernard Malissen(INSERM、パリ、フランス)から入手したC57BL/6バックグラウンドで、8〜10週齢のTcrdEGFPマウスで実験を行います。IACUCが承認した手順に従って、動物の体重に基づいてケタミン(120 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)をi.p.注射してマウスに麻酔をかけます。呼吸数(毎分55〜65回の呼吸)、つま先のつまみ、および眼瞼反射によって麻酔のレベルを評価します。
2. 外科的平面麻酔に達したら、マウスの後肢をテープで加熱パッドに固定し、直腸体温計で監視できる体温を維持します。麻酔が切れている兆候がある場合(例:.、呼吸数の増加、まばたき、眼球反射に対する眼筋のけいれん反応)、マウスが完全に鎮静するまで、一度に50μLのケタミン/キシラジンを再投与します。.
3. 50 μL の Hoechst 33342 (10 mg/mL) を 315 μL の 0.9% 生理食塩水で希釈して、核色素を調製します。最終濃度は、マウスの体重に基づいて 37.5 mg/kg です (約容量 200 μL)。マウスに麻酔をかけたら、ツベルクリン注射器を使用して、眼窩後静脈洞にヘキストをゆっくりと注入します
   注:1〜2分待ってから次のステップに進み、マウスがレトロオービタル注入後の循環体積の変化に順応できるようにします。
4. 目が乾燥するのを防ぐために、少量の潤滑剤を目の上に置きます。

2. マウス手術:腸粘膜を露出させる開腹術

1. 下腹部の正中線に沿って皮膚と腹膜を縦に2cm切開し、画像化する腸の領域を外部化します。
2. 角度のある鉗子を使用して、盲腸を腹腔から慎重に引き出し、画像化する小腸の領域を特定します。この過程で腸間膜血管を引き裂かないように注意してください。潜在的な損傷や出血を最小限に抑えるために、鉗子で腸をつかんだりつまんだりしないでください。
3. 小腸の適切な領域(2〜3 cm)を、最小限の糞便内容物を含むイメージングに見つけます。盲腸と残りの小腸を慎重に腹腔に戻しますが、関心のあるセグメントは外部化したままにします.
   注:このステップでは、盲腸に穴を開けたり、腸間膜血管系を乱したりしないでください。
血管
4. 間の下にある腸間膜の両側に2対の鉗子を置き、鉗子の先端をそっとこすり合わせて膜に穴を開けます(図1)。これにより、腸の下の腹腔を閉じるときに針が腸間膜を通過できるようになります。
5. 腸のループを外部化したまま、切開部を閉じます。角度のついた鉗子と、5cmの縫合糸に取り付けられた湾曲した先細りの先端針を使用して、腹膜の片側を貫通し、前のステップで開けた穴を通って、腹膜の裏地の反対側を通って上に進みます。1つの縫合糸を切開部の上部に、もう1つの縫合糸を切開部の下部近くに配置します
   注:このステップでは、血管系を損傷しないようにしてください。
6. このプロセスを繰り返して、切開部の中央、下にある腹膜の前の縫合糸の間に1つの縫合糸を配置することにより、腸ループの下の皮膚を閉じます
   注:イメージ化する領域のみを外部化することが重要です。これにより、イメージング中の無関係な動きが減少します。腸間膜動脈を縛ることは避けてください。
7. 電気焼灼を使用して、抗腸間膜境界に沿って穿孔の線を作ります。焼灼の直後に、腸の表面に数滴の水を適用して、追加の熱による組織の損傷を防ぎます。キムワイプで吸い取り、残留水分を取り除きます。
8. Vannasハサミを使用して焼灼組織の遠位端に小さな水平スリットをカットし、焼灼ラインの長さに沿って外部組織セグメントの近位端(長さ約1.5cm)に向かってカットを進めて、粘膜表面を露出させます。
   注意: 必要に応じて、鉗子を使用して、露出した粘膜表面に残っている余分な糞便内容物をそっと取り除きます。
9. マウスの腹部を湿らせたキムワイプで覆い、組織が脱水状態になるのを防ぎます。マウスを蓋付きの容器に入れて顕微鏡に運びます。

3. スピニングディスク共焦点顕微鏡による画像取得

1. HBSS溶液の1 μM AlexaFluor 633 150 μLを、35 mmディッシュの底部にガラスカバーにピペットで移します。開いた粘膜表面がカバーガラスに直接接触するようにマウスを配置します。
2. 顕微鏡のヘッドを後ろに傾け、事前に温めたインキュベーターのイメージングステージ上のカバースリップした皿にマウスを置きます。または、体温を維持するためにマウスを加熱ブランケットで覆います。
3. イメージングソフトウェアを起動します。各レーザーの励起強度と露光時間は、光退色を回避し、時間点間の間隔を最小限に抑えるために、それぞれ10〜15 mWまたは120〜150 msを超えてはなりません。フレーム平均を「2」に調整し、EMゲイン機能をオンにすると、バックグラウンドノイズが低減されます。ピクセルサイズの正しい測定を確保するために、63倍の対物レンズキャリブレーションを選択します.
   注:上記の設定は、初期参照を提供することを目的としていますが、個々の顕微鏡構成によって異なります。
4. 405 nm レーザーと 20x エア対物レンズを使用して、核を視覚化し、目立った動きがない、または目視でドリフトする絨毛のフィールドを見つけます。呼吸、蠕動運動、または心拍による人工的な動きの領域は避けてください。
5. XYスキャンを使用して、対象分野のXY座標を記録し、グリセロール浸漬63X対物レンズに切り替えます。
6. 選択したフィールドの絨毛が安定していることを確認するには、405 nm チャネルで最大 1 分間ライブ画像を取得します。
7. 405 nm チャネルでライブ画像を取得しながら、ピントを調整して、絨毛先端のすぐ下にある直交面を見つけます。絨毛先端上皮のすぐ下から絨毛下隅まで、約15〜20 μmの核の分解が困難になるまで、1.5 μmステップでZスタックを取得します。
   注:上記の露光時間を使用して3つのチャンネル(405、488、640 nm)でイメージングする場合、約20秒間隔で3つのチャンネルすべてを連続して取得することができます。
8. 取得を開始してから3〜5分後にソフトウェアを解析モードで開き、画像の安定性とγδIELの運動性を確認します。絨毛の各フィールドについて30〜60分間画像を取得し続けます。各マウスの 2 〜 3 個のフィールドを記録します。イメージング中は、5分ごとにマウスを監視します。

結果

図1:鉗子を使用して腸間膜に穴を開ける。メンブレンの両側に鉗子を置き、縫合糸用の穴を開けます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35mmディッシュ、No.1.5カバースリップ	マテック	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 ヒドラジド	インビトゲン	A30634 (英語)
BD PrecisionGlide 皮下注射針 - 27g	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14*826*48
BDスリップチップ滅菌シリンジ - 1 ml	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14-823-434
BDツベルクリンシリンジ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14勝829敗9分
解剖ハサミ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	08-940
電気焼灼	サーモフィッシャーサイエンティフィック	50822501
密閉型インキュベーションチャンバー	オコラボ		顕微鏡
アイニードル、サイズ #3; 1/2 サークル、テーパーポイント、12 mm コード長	ロボズ	RS-7983-3
ハンクのバランスの取れた塩溶液	シグマ・アルドリッチ	55037C
ヘキスト33342	インビトゲン	H3570-J
反転DMi8	ライカ		顕微鏡
ケタミン	パットニー		麻酔
キムワイプ	VWRの	21905-026
McPherson-Vannasはさみ3インチ(7.5 cm)ロング5X0.15mmストレートシャープ	ロボズ	RS-5600
非吸収性外科用縫合糸、シルクスプール、ブラックブレイド	フィッシャーサイエンティフィック	NC0798934
ニュージェント鉗子4.25インチ(11 cm)ロングアングルスムース1.2mmチップ	ロボズ	RS-5228
Puralube Vet 軟膏	デクラ		潤滑性眼軟膏
63x 1.3 N.A. HC PLAN APOグリセロール浸対物レンズ、iXon Life 888 EMCCDカメラ、405 nmダイオードレーザー、488 nm DPSSレーザー、640 nmダイオードレーザーを搭載したスピニングディスクYokogawa CSU-W1	アンドール		共焦点システム
キシラジン	アコーン		麻酔