アポトーシスTリンパ球由来の微粒子のin vitroでの単離

要約

出典: Yang, C. et al., Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオは、アクチノマイシン-Dによる処理後のTリンパ球由来の微粒子(LMP)の生成とTリンパ球からの単離を示しています。

プロトコル

1. LMPの生産と特性評価

>注:汚染を防ぐために、この実験で使用されるすべての材料が無菌またはオートクレーブされていることを確認してください。RTのすべての手順は、特に明記されていない限り、無菌条件下で生物学的安全キャビネット内で行ってください。

1. MPの刺激と収集
   1. 1,000万個のCEM T細胞のアリコートを37°Cのウォーターバスで解凍します。X-VIVOなどの10 mLの予熱滅菌滅菌チューブで15 mLの滅菌チューブで希釈し、200 g x 5分で遠心分離します。上清を吸引し、5 mLの予熱培地に細胞を再懸濁します。
   2. X-VIVOなどの15 mLの予熱造血培地を入れたT75組織培養フラスコ(浮遊細胞用)に細胞を移し、加湿インキュベーターで37°C、5%_CO2で4日間インキュベー
   トします。
   3. 4日後、すべての培地と細胞を100 mLの新鮮な培地が入ったT175組織培養フラスコに移します。細胞が200万細胞/mlの密度に成長するまで、同じ条件下で約72時間細胞をインキュベートし続けます。
   4. それぞれ150 mLの新鮮な培地を含む4つのT175フラスコに細胞を均等に分割し、細胞が200万/mlの密度まで増殖するまで(約48時間のインキュベーション)、細胞培養を続けます。
   5. 200 x gで5分間遠心分離することにより各フラスコから細胞を採取し、300 x 10⁶細胞を150 mLの新鮮な培地を含む新しいT175フラスコに再懸濁して、200万/ mlの細胞密度を維持します。
   6. アクチノマイシンD(DMSOに2 mg/mlで溶解)を最終濃度0.5 μg/mlの培地に加え、24時間インキュベー
   トします。
   7. すべての培地を50 mLのコニカルチューブに移し、750 x gで細胞を5分間スピンダウンします。上清を50 mLのコニカルチューブに移し、1,500 x gで15分間遠心分離して大きな細胞フラグメントを除去します。
   8. 上清を250mlのボトルに移し、12,000 x gで50分間超遠心分離します。
   9. LMPsが豊富なペレットを50 mLチューブ内の40 mL滅菌PBSで12,000 x gの遠心分離により50分間洗浄し、この手順を2回繰り返します。
   10. 最後の洗浄上澄み水を収集します。これは車両の制御として使用されます。LMPペレットを1 mLのPBSに懸濁し、1.5 mLの滅菌マイクロチューブに移します。単離されたLMPを-80°Cで分注して保存します(複数回の自由融解サイクルを避けるため)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CEM T細胞	ATCCの	CCL-119
X-VIVO 15 ミディアム	カンブレックス、ウォーカーズビル	04-744Q
フラスコT75	ザルシュテット	83.1813.502
フラスコT175	ザルシュテット	83.1812.502
アクチノマイシンD	シグマケミカル(株)	A9415-2ミリグラム
PBSの	ライフテクノロジー	14190-144
0.22μmフィルター	ザルシュテット	83.1826.001
細胞インキュベーター	マンデル	ヘラセル150
低速遠心分離機	IECの	セントラ8R
高速遠心分離機	ベックマン	アバンティJ8
250mlボトル用高速ローター	ベックマン	JLA16.250
50mlチューブ用高速ローター	ベックマン	JA30.50