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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 調製したナノ粒子人工抗原提示細胞で抗原特異的CD8+ T細胞を濃縮します。
- CD8+ T細胞を単離します。
- イソフルランへの曝露とそれに続く子宮頸部脱臼への曝露によって動物を安楽死させます。
- 野生型C57BL/6jマウスから脾臓とリンパ節を採取し、PBS溶液に入れます。臓器を浸軟させ、PBSを頻繁に洗浄しながら滅菌済みの70μmセルストレーナーで細胞を溶出します。
- 非CD8+ T細胞を除名するには、ノータッチCD8+ T細胞単離キットを使用し、製造元の指示に従ってください
注:各抗原条件には、少なくとも3 x 106 CD8+ T細胞が必要です。
- ナノ粒子aAPCsを添加してCD8+ T細胞に結合させます。
- 単離後、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)および2 mM EDTAを含むPBS中100 μLまで濃縮します。
- CD8+ T細胞10個あたり10個の11個のaAPC結合ペプチド負荷MHC-Igの比率に基づいて計算することにより、追加するaAPCの数を決定します。
- aAPC粒子とCD8+ T細胞を4°Cで1時間インキュベートし、滅菌済みの5 mLポリスチレン丸底チューブで連続的に混合します。
- CD8+ T細胞を溶出および培養するために、補充した培地とT細胞増殖因子(TCGF)を調製します。
- 補充培地の場合は、完全な RPMI 1640 培地(グルタミンを含む)に 1x 非必須アミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、0.4x ビタミン溶液、92 μM 2-メルカプトエタノール、10 μM シプロフロキサシン、および 10% ウシ胎児血清(FBS)を添加します。
- TCGFを作成するには、確立されたプロトコルに従ってください。
手記： TCGFは、ヒト免疫サイトカインの自社カクテルであり、T細胞の成長に必要な追加の刺激シグナルを提供するために不可欠です。TCGFは、IL-2、IL-7、またはIL-15などの既知のT細胞刺激性サイトカインと交換できます。しかし、それぞれがそれに応じてT細胞応答を分極してもよい。
- aAPCおよびCD8+ T細胞混合物を洗浄し、濃縮します。
- 磁性粒子aAPCを洗浄し、最初に0.5%BSAおよび2mM EDTAを含むPBSバッファーを使用し、次に補充培地を使用し、次に1%TCGFを含む補充培地を使用します。
- 1% TCGFを添加した培地500 μLでaAPCおよび濃縮CD8+ T細胞を溶出します。
1- % TCGFを添加した培地のウェルあたり160 μL、2.5 x 105 CD8+ T細胞/mLの濃度で、96 U底プレートの血球計算盤とプレートを使用して細胞をカウントします。
- 表面にペプチドをロードしたMHC-Igのみ(共刺激シグナルなし)のaAPCを使用して単離する場合は、ステップ4.5を完了します。表面にペプチドをロードしたMHC-Igと共刺激シグナルの両方を持つaAPCを使用して単離する場合は、ステップ5に進みます。
- 濃縮画分に表面上の共刺激シグナルでコーティングされた磁性粒子を添加し、磁場を添加してT細胞の表面に刺激シグナルを共クラスター化します。
- 濃縮された画分に、等モル(またはアプリケーションによってはそれ以上)刺激性抗体を、粒子上のペプチドロードMHC-Igの数に
添加します。
- 共刺激性磁性粒子を濃縮CD8+ T細胞に4°Cで1時間結合させます。
- 長さ1.9cm(0.75インチ)の2つのネオジムN52ディスク磁石の間に培養プレートを配置して磁場を追加します.
手記：N52ディスク磁石は非常に強い磁場を持っています。どちらも、培養プレートに置くときに互いに取り外すのが難しいため、磁石の間にスペーサーを挟んで保管するように注意する必要があります。インキュベーターの金属部品に磁石がくっつくのを最小限に抑えるために、磁石を50mLの円錐形チューブ発泡スチロール容器の底部と上部の両方に置きます。
2. 作製したナノ粒子人工抗原提示細胞による抗原特異的CD8+ T細胞の増殖と検出
- aAPCsおよびCD8+ T細胞を含む96 U底ウェルプレートを加湿した5% CO2, 37 °Cインキュベーターに3日間加えます。3日目に、2% TCGFを添加した培地のウェルあたり80μLを細胞に供給し、7日目までインキュベーターに戻します。
- 7日目に、刺激した細胞を5mLの丸底チューブに回収してカウントします。
- すべての溶液が回収されたら、回収した細胞をスピンダウンして、0.05%アジ化ナトリウムと2%FBSを含む0.5 mLのPBSに再懸濁します。トリパンブルーで染色し、血球計算盤で数えることにより、生存細胞をカウントします。
- 50,000〜500,000個のカウントされた細胞を、抗原特異的染色のための2つの新しい5 mL丸底チューブに取り出します。1 つのチューブは同族のペプチド-MHC 染色に使用され、もう 1 つのチューブはバックグラウンド染色を決定するための非同族染色に使用されます。
- 0.05%アジ化ナトリウムおよび2%FBS含有PBSおよび2%FBS含有PBS含有0.05%アジ化ナトリウムおよび2%FBS含有100μLのビオチン化MHC-Igをそれぞれの同族チューブおよび非同族チューブに1μg加え、4°Cで1時間。
- 第二級ストレプトアビジンと生死染色を添加します。過剰なビオチン化MHC-IgをPBSで遠心分離して洗い流します。次に、すべてのサンプルを1:350の比率のフィコエリトリン(PE)標識ストレプトアビジンと1:1000の比率の生/死固定可能な緑色死細胞染色で4°Cで15分間染色します。
- フローサイトメーターですべてのサンプルを読み取り、抗原特異的細胞の特異性と数を決定します。
- 遠心分離により余分な二次染色および生/死染色を洗い流し、0.05%アジ化ナトリウムおよび2%FBSを含む150μLのPBSバッファーで再懸濁して、フローサイトメーターで読み取ります。
- データ解析ソフトウェアで抗原特異的細胞の数と割合を決定します。
- 抗原特異的細胞の割合を決定するには、live+、lymphocyte+(側方散乱による前方散乱)、CD8+、およびDimer+のそれぞれの順に次のゲートを使用します。非同族と同族染色を比較して、Dimer+ゲートを決定します。
- サンプル中の抗原特異的細胞の割合を測定するには、非同族のMHC-Ig染色から同族のMHC-Ig染色のDimer+の割合を差し引きます。
- この抗原特異的細胞の割合を使用して、カウントされた細胞の数を掛けると、濃縮と増殖から生じる抗原特異的細胞の数が得られます
手記：コンペンセーションは、このパネルで使用される蛍光色素とスペクトルが重複するため、フローサイトメーターで設定する必要があります。