マウス腹腔から初代肥満細胞を単離する技術

要約

出典:Tsvilovskyy, V., et al.Ca²⁺イメージングおよび脱顆粒アッセイによる腹膜由来マスト細胞の単離とその機能特性評価。J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオは、成体マウスの腹腔から成熟結合組織型肥満細胞を単離するための腹膜洗浄法を示しています。初代免疫細胞の混合物を腹腔から単離すると、適切な培養条件下で肥満細胞の選択的増殖が行われます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腹腔内洗浄によるPMCの分離

1. 細胞単離に先立ち、表1に記載されている材料を調製します。
2. PMCの分離には、8〜14週齢の雄マウスを使用します。CO2吸入によりマウスを安楽死させ、反射神経の喪失により死亡を確認する。マウスに70%エタノールをスプレーし、ピン(背側を下にして)を使用してフォームブロックに固定します。鈍いエッジハサミを使用してマウスの腹側皮膚を取り除きます。腹腔の損傷を避けてください.
   手記：通常、このプロトコルは、C57BL/6N株の遺伝的背景を持つマウスに使用します。
3. 27 Gの針を備えた10 mLのシリンジを使用して、7 mLの氷冷RPMI培地と5 mLの空気を腹腔に注入します。針を腹膜に慎重に押し込み、臓器に穴を開けないでください。精巣上体脂肪の領域のスポットを使用して、臓器穿孔のリスクを減らします。
4. 注入後、マウスを1分間振とうして、腹膜細胞をRPMI培地に剥離します。内臓の損傷や腹腔の血液汚染を避けるために、マウスを強く振らないでください。
5. 10 mLシリンジに新しい20 Gカニューレを装備して再利用します。フォームブロックを傾け、ベンチで軽くたたいて内側の臓器を片側にずらし、反対側から中程度の吸引を容易にします。20 Gの針を挿入し、斜めにし、腹部から液体を穏やかかつゆっくりと(~0.5 mL / s)吸引して、内臓による詰まりを防ぎます。.できるだけ多くの水分(通常は5〜6 mL)を収集します。
6. シリンジから針を取り出し、採取した細胞懸濁液を氷上の採取チューブに移します。目に見える血液汚染がある場合は、サンプルチューブを廃棄してください。
7. 細胞懸濁液を入れたチューブを~300 x gで5分間遠心分離します。滅菌フードの下で上清を吸引します。各マウスについて、サンプルペレットを4 mLの冷(4–10 °C)PMC培地に混合し、細胞懸濁液を25 cm²の培養フラスコに移します。成長因子IL-3とSCFをそれぞれ最終濃度10 ng/mLと30 ng/mLに添加します。細胞が入ったフラスコをインキュベーター(37°C、5%CO₂)に入れ、次の手順まで~48時間インキュベー
トします。

>表 1: ステップ 1 の資料。

名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名

1	氷
2	10 mLシリンジ
3	27G針
4	20Gの針
5	発泡スチロールのブロックとピン
6	収集チューブ(50 mLプラスチック遠心分離チューブ)
7	70%エタノール
8	RPMI Medium (事前に冷やして氷上に保管)
9	PMCミディアム:RPMIミディアム+ 20%FCS(子牛胎児血清)+ 1%ペニシリンストレプトマイシン溶液(ペン連鎖球菌)
10	ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 - DPBS(Ca2+およびMg2+なし)
11	培養フラスコ(25 cm)
12	成長因子ストック溶液(IL-3:1μg/μL;SCF:2.5μg/mL)
13	血清ピペット(10 mL)
14	ピペットチップは滅菌済み(20–200 μL)
15	血球計算盤
16	ベンチ遠心分離機
17	はさみと鉗子
18	マウス用CO2チャンバー
19	オープン滅菌フード
20	密閉型滅菌フード
21	セルインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)
22	トランスファーピペット(20–200 μL)

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMIミディアム	サーモサイエンティフィック	21875034
DPBSの	シグマ・アルドリッチ	14190144
FCSの	サーモサイエンティフィック	R92157
IL-3	R&Dシステム	403ミリリットル
SCFの	サーモサイエンティフィック	PMC2115
ペンストレップ	サーモサイエンティフィック	15140122
培養フラスコ(25 cm)	グライナーバイオワン	69160
15 mLプラスチック遠心チューブ	ザルシュテット	6,25,54,502
ベンチ遠心分離機	ヘレウス	メガフュージ 1.0R