スパイラルマイクロ流体チャネルを用いた気管分泌物からのラベルフリー好中球分離

要約

出典:Ryu, H., et al., Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics.J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、スパイラルチャネルを備えたマイクロ流体デバイスを使用して、気管分泌物から好中球を分離する方法を示しています。このデバイスは、さまざまな厚さと台形のチャネルを利用することにより、細胞サイズに基づく効率的な分離を実現します。力の相互作用により、大きな好中球が内壁付近に蓄積し、赤血球とムチン凝集体が外壁付近に留まり、効果的な好中球の分離が確保されます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. デバイス作製とソフトリソグラフィー

>注:標準的なソフトリソグラフィー技術を使用して、ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロチャネルを作成しました。

1. PDMS前駆体を塩基剤と硬化剤の比率10:1で混合します。
2. 30 gのPDMS前駆体混合物を微細機械加工アルミニウム型(寸法については図1を参照)に流し込み、20 gのPDMS前駆体混合物を100 mmシャーレに注ぎます
   手記：ペトリ皿は、支持層としてPDMS(~3mm)の厚膜を作るために使用されます。PDMSの支持層は、マイクロ流体工学全体に均一な物理的表面特性を提供します。あるいは、スライドガラス上に薄いPDMSフィルムを使用することもできます。特定のチャネル寸法のマスターモールドは、アルミニウムシートにマイクロミリングによって設計および製造されました。この研究で使用したスパイラルチャネルは、1つの入口と2つの出口を備えた8ループスパイラルマイクロチャネルであり、半径を8 mmから24 mmに拡大して、効率的なサイズベースの分離を実現しました。
3. 型とペトリ皿を真空デシケーターに入れて、表面に気泡が見えなくなるまで、通常は5〜10分間脱気します。
4. 真空を解除し、型とシャーレを90°Cオーブンに1時間置きます
   手記：オーブンの代わりにホットプレートやその他の加熱ツールを使用できます。
5. 型とペトリ皿をオーブンから取り出し、室温で10分間冷まします。
6. 輪郭を慎重に切り取り、2mmパンチャーを使用してデバイスの流体アクセス穴を開けます。
   手記：パンチのサイズは、チューブまたは流体ガイドのサイズによって異なります。
7. デバイスのチャネル側にテープとPDMSの厚いフィルムを接着し、鉗子で慎重に剥がしてほこりを取り除きます。
8. デバイスのチャネル側とプレーンPDMSの両方をエアプラズマで処理し、準備したプレーンPDMSの支持層と結合します(図1A)。
9. チップを50 mm x 70 mmのスライドガラスに置き、70°Cのオーブンに少なくとも30分間置くと、接着強度が向上します。

2. 人工呼吸器を装着した患者からの気管分泌物採取

>注:気管分泌物は、標準的な成人の換気患者に対応するために従来の方法から変更されたプロトコルを使用して、通常の日常的な気道ケア中に機械的に換気された患者から得ることができます。サンプルは匿名化され、処理のためにすぐに送られました。

1. 気管吸引が適応となる場合は、カテーテルを使用して気道分泌物を抽出します。.
2. カテーテルを気管内チューブの途中まで慎重に進め、事前に充填された10mLシリンジから5mLの0.9%滅菌正常生理食塩水を注入します。.
3. カテーテルが完全に前進した場合、または抵抗が満たされた場合は、分泌物を吸引し、滅菌した ?? 源収集容器に収集します。.
4. 滅菌した痰容器に10mLの気管分泌物を集め、氷の上に置きます。.サンプルをすぐに送信して処理します。

3. 気管分泌物サンプル調製

>注:すべての実験は、適切な個人用保護具を備えたバイオセーフティキャビネットの下で行う必要があります。

1. プラスチック製の10 mLシリンジ(10倍希釈用)を使用して、1 mLの気道分泌物サンプルを9 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に分散させます。鈍いピペットを使用して、粘液サンプルを均質化します。
2. 40 μmのナイロン製セルストレーナーで希釈液を濾し、マイクロフルイディクスのアクセスホールやチャネルを塞ぐ可能性のある大きな塊や血栓を取り除きます。処理後、サンプルを氷の上に置きます。
3. 100倍容量のPBSバッファーを使用して各サンプルの希釈液を分散させ、懸濁液を1,000倍希釈します。解離操作全体を通して、サンプルを氷の上に置きます。

4. 実験的な設定

>注:すべての実験は、適切な個人用保護具を備えたバイオセーフティキャビネットの下で行う必要があります。

1. PDMSチップを流体ガイドで組み立てて、4つのスパイラルマイクロチャネルのそれぞれに均一な流れを印加します(図1B)。
   手記：4つのチャネルを使用して、並列化によるスループットの向上と、得られた懸濁液の体積と細胞密度の最適化を行いました。流体ガイドは、透明樹脂を使用した光造形タイプの3Dプリンターで設計・製作されています。流体ガイドの入口と出口ポートは、メスのルアーコネクタを使用して、接続を容易にし、動作中の安定したシーリングを実現します。
2. 1/16インチのオスルアーコネクタを流体ガイドの入口、内壁(IW)出口、および外壁(OW)出口ポートに接続し、シリコンチューブをサンプル懸濁液に接続します。
3. 入口と出口の両端に鈍い先端を挿入して、サンプルリザーバーの底に到達します。
4. 蠕動ポンプをインレットチューブに接続します。
5. インレットチューブとIWアウトレットチューブの端をサンプルリザーバーに配置し、OWアウトレットチューブの端を廃棄物リザーバーに配置します(図1C、D)。
6. カルシウムとマグネシウムを含まないろ過済みPBSの50 mLチューブをサンプルリザーバーに入れます。
7. 低流量(~1 mL/分)でポンピングを開始し、デバイスをプライミングします。
   手記：気泡がチャネルに捕捉されたら、ピンセットでチャネルの上部を押して、気泡を不安定にして排除します。デバイスに緩衝液が完全に充填されたら、PBSチューブを交換して気道分泌サンプルチューブを準備します。
8. サンプルをサンプルリザーバーに入れたら、ペリスタルティックポンプのスイッチを入れ、流速を4 mL/分に設定します(図1C、D)。
9. サンプル量が指定容量(~1 mL)に達したら、操作を停止し、シリコンチューブを外します。
   手記：提案された方法は、大量の希釈剤(>50 mL)を微量遠心チューブ容量(~1 mL)に還元するのにより効率的です(図2)。

結果

図1:スパイラルマイクロ流体デバイスと実験設定。 (A)スパイラルマイクロ流体工学、および(B)流体アダプターで組み立てられたデバイスの画像を撮影します。(C)スパイラル慣性マイクロ流体を用いた閉ループ分離の模式図。粒子/細胞濃縮されたストリーム(IW出口)を元のサンプルリザーバーに再循環させることにより、免疫関連細胞を少量に濃縮し、ムチン凝集体とマイナーな赤血球を含むバックグラウンド流体をOW出口に接続された廃液チューブを通じて連続的に除去しました。(D)実験装置と10μm粒子の蛍光像、軌跡(緑)、スパイラルチャネルの出口(右上)。

図2:閉ループ慣性マイクロ流体工学を使用した気道分泌サンプル調製の概略図。臨床的に誘発された気...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PDMS前駆体	ダウコーニング	184 SIL エラストキット 3.9KG	ベースと硬化剤の比率は10:1
VWR重力対流式オーブン	VWRの	414005から128	PDMS前駆体は90°Cで硬化します。
100mmシャーレ	VWRの	89000-324	PDMS支持層の作製
ハリスユニコアパンチャー	シグマアルドリッチ	WHAWB100076	直径2mmまたはチューブサイズに応じてその他
エアプラズママシン	フェムトサイエンス	可愛い	PDMSデバイスの底面ベースへの表面プラズマ処理。
2インチ x 3インチのスライドガラス	テッド・ペラ(株)	2195	PDMSデバイスをサポートするには
Masterflex スプール プラチナ硬化シリコン チューブ、L/S 14	コール・パーマー	EW-96410から14	マイクロ流体および蠕動ポンプ用チューブ
1/16インチルアーコネクタ、オス	ハーバードの装置	PC2 72-1443	流体ガイド用コネクタ
50mLファルコンチューブ	コーニング	21008-940	サンプルの収集と調製
リン酸緩衝生理食塩水、カルシウムとマグネシウムを含まない1倍	コーニング	45000-446	サンプルを希釈するための緩衝液
ハリヤードクローズドサクションカテーテル、エルボー、14F /チャンネル4.67mm	ハリヤードヘルス	22113	気管切開吸引カテーテル
0.9% 滅菌生理食塩水、10mL プレフィルドシリンジ	BDポジフラッシュ	NHRICの:8290-306547	患者からの気管切開採取用
SecurTainer™ III 検体容器 20mL	インポート	1176R36	滅菌喀痰(気道分泌物)採取容器
ルアーロックチップ付きシリンジ、10mL	BDの	BD309604	粘液サンプルをピペットで均質化し、サンプルチューブの底に到達するには
BDブラントフィルニードル、BDルアーロックチップ付き	BDの		粘液サンプルをピペットで均質化し、サンプルチューブの底に到達するには
40μmナイロンセルストレーナー	隼	21008-949	マイクロフルイディクスのアクセスホールやチャネルを塞ぐ可能性のある大きな塊や血栓を取り除くため。
蠕動ポンプ(Masterflex L / Sデジタルドライブ)	コール・パーマー	HV-07522から30	マイクロ流体工学の操作

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