GM-CSF産生ヘルパーT細胞をナイーブT細胞から分化するためのIn Vitro技術

要約

出典:Lu, Y., et al. マウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)産生Tヘルパー(T_HGM)細胞のin vitro分化。J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、顆粒球-マクロファージ-コロニー刺激因子またはGM-CSF産生Tヘルパー細胞(T_HGM)のin vitro分化を示しています。単離されたナイーブT細胞は、_THGMへの分化を刺激され、これは高い細胞内GM-CSF産生と他のヘルパーT細胞特異的サイトカインの低発現を検出することによって確認されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 試薬と材料の準備

1. 2%ウシ胎児血清(FBS)と1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)500 mLを調製します
   手記：最適な結果を得るために、手順全体を通してバッファーを氷上に保ちます。
2. RPMI 1640、10% FBS、および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含む 50 mL の完全 RPMI 培地を調製します。_THGM細胞の分化には、50 μM β-メルカプトエタノールを含む完全なRPMI培地を使用してください。β-メルカプトエタノールをドラフトに加えます。
3. 抗CD3e濃縮ストックをPBSで3 μg/mLに希釈し、7.5 mLの抗CD3e抗体混合物を調製します。各ウェルに150 μLの抗体混合物を加えて48ウェルプレートをコーティングし、プレートを37°Cで少なくとも1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
4. はさみと鉗子を滅菌し、解剖の合間に70%エタノールに保ちます。

2. マウス脾細胞の調製

1. マウス(生後6〜8週間)を、施設で承認されたCO₂窒息または子宮頸部脱臼を使用して安楽死させます。マウスに70%エタノールをスプレーし、背中のポリスチレンブロックに取り付けます。マウスを生物学的安全キャビネットに移し、次の手順に進みます。
2. 鉗子で皮膚を押さえ、左側の胸郭より下の皮膚をハサミで約4cm切ります。腹膜嚢を開いて脾臓を露出させ、滅菌鉗子を使用して脾臓を抽出します。
3. 70 μmのセルストレーナーを50 mLのチューブに置き、2 mLのバッファーで事前に湿らせます。脾臓をセルストレーナー(1つのセルストレーナーに対して2〜3個の脾臓)に置き、5mLシリンジプランジャーの端を使用して浸軟します。
4. ストレーナーとチューブを1〜2 mLの細胞分離バッファーで数回すすぎ、すべての細胞がチューブに洗い流されます。細胞ストレーナーを廃棄し、細胞を350 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
5. 細胞ペレットを5 mLの冷(4 °C)アンモニウム-塩化カリウム(ACK)溶解バッファー(150 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、0.1 mM Na₂EDTA;pH 7.2–7.4)で再懸濁し、2分間穏やかに混合します。10 mLの完全RPMI培地を加えてACKバッファーを中和し、直ちに細胞を350 x gで4°Cで5分間遠心分離します。遠心分離後は上清を捨てます。

3. 磁性CD4マイクロビーズと細胞分離カラムを用いたCD4⁺ T細胞の単離

1. 細胞ペレットを5 mLの細胞単離バッファーに再懸濁します。プレセパレーションフィルター(30 μm)を使用して細胞懸濁液を新しい15 mLチューブにろ過し、破片を除去します。
2. 細胞懸濁液10μLを取り込み、バッファー90μLを加えて10倍希釈します。希釈した細胞懸濁液10 μLを取り出し、トリパンブルー10 μLと混合して細胞計数を行います。血球計算盤で細胞をカウントし、生存細胞の収量を決定します。
3. 細胞を350 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨てます。
4. 細胞を10⁷細胞あたり90 μLのバッファーに再懸濁します。10^{7細胞あたり}10 μLの磁性CD4マイクロビーズを添加します。細胞を4°Cで15分間インキュベートします。最適な結果を得るには、インキュベーション中に5分ごとに細胞懸濁液を穏やかに混合します。
5. 細胞のインキュベーション中に、マグネティックスタンドに分離カラムを置きます。カラムを2 mLのバッファーで事前に湿らせます。
6. 細胞/ビーズのインキュベーションが終了したら、細胞を5 mLのバッファーで洗浄し、350 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
7. 細胞を1 mLのバッファーに再懸濁し、サンプルを細胞分離カラムにロードして、流します。15 mLの遠心チューブを使用して、CD4-細胞画分を回収します。1 mLの緩衝液を加えて、リザーバーが乾く前に洗浄します。洗濯手順を2回繰り返します。
8. 細胞分離カラムをマグネットスタンドから取り外し、新しい15 mL遠心チューブの上に置きます。細胞分離カラムに2 mLの細胞分離バッファーを加え、プランジャーをしっかりと適用して細胞をカラムから押し出します。
9. フラクションを350 x gで4°Cで5分間遠心分離し、CD4⁺細胞を得ます。上清を捨てます。

>4. Naive CD4⁺ T細胞(CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi)の蛍光活性化セルソーティングとTH GM分化による精製

1. 得られたCD4⁺細胞ペレットを500μLのバッファーに再懸濁します。CD4-PerCp(2.8 μg/mL)、CD44-APC(2.4 μg/mL)、^CD25-PE(2 μg/mL)、およびCD62L-FITC(10 μg/mL)を含む蛍光標識抗体混合物と細胞を混合します(表1)。細胞を光から保護しながら、氷上で20〜30分間インキュベートします><。 手記：抗体の濃度は、以前にラボで最適化されました。記載されている抗体の数は、1〜2匹のマウスの細胞に対するものです。
2. インキュベーション後、細胞を5 mLのバッファーで洗浄し、細胞を350 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
3. 上清を捨て、細胞を500 μLのバッファーに再懸濁します。ナイロンメッシュを使用してセルを再度フィルタリングします。
4. 細胞懸濁液をFACSチューブに移し、細胞選別を行います。コレクションFACSチューブを500μLのバッファーでプレコートします。
5. FACSソーティングにより、(ナイーブCD4⁺ T細胞の)CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi集団を得る。最初にCD4 ⁺ CD25^-にゲートし、次にこの集団からCD44^loCD62L^hi細胞を選択します。
6. ナイーブなCD4⁺ T細胞画分を新しい15 mL遠心チューブに集めます。細胞を350 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨てます。
7. ナイーブCD4⁺ T細胞を106細胞/mLの濃度で、50 μM β-メルカプトエタノールを含む完全RPMI培地に再懸濁します。
8. プレコーティングに使用した抗CD3e抗体を48ウェルプレートに吸引します。各ウェルに 25 万個 (250 μL) の細胞に IL-7 (2 ng/mL)、抗 CD28 (1 μg/mL)、および抗 IFNγ (10 μg/mL) を播種します (表 1).
   手記：サイトカインと抗体の濃度は、以前に研究室でT_HGM細胞の分化のために最適化されていました。
9. 細胞を37°Cで5%_CO2と3日間インキュベートします。インキュベーション中に培地を変更しないでください。

5. In vitroで作製したマウスT_HGM細胞の解析

1. 顕微鏡を用いて、分化後3日目の細胞分化を確認します。細胞を回収し、350 x gで4°Cで5分間遠心分離し、完全なRPMI培地で細胞を2回洗浄します。
   手記：分化した細胞は、ナイーブなCD4⁺ T細胞よりもサイズが大きくなります。
2. 細胞を1 mLの完全RPMI培地に再懸濁します。10 μLの細胞懸濁液を10 μLのトリパンブルーとよく混合して、血球計算盤で細胞数を決定します。分化した細胞を3つのポーションに分けて再刺激と分析を行います
   手記：細胞内サイトカイン染色には、≥50万個の細胞が必要です。
3. 細胞内サイトカイン染色では、タンパク質輸送阻害剤(1 μL/mL)の存在下で、ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)(100 ng/mL)およびイオノマイシン(1 μg/mL)で細胞を4〜6時間再刺激します。
   1. 細胞を回収し、抗CD4抗体(PerCP標識、0.2 mg/mL、1:100希釈、またはFITC標識、0.5 mg/mL、1:100希釈)で30分間染色します。
   2. 細胞を200 μLの固定バッファーで20〜60分間固定します。固定後、細胞を1 mLの透過化緩衝液で2回洗浄します。
   3. GM-CSF(PE標識、0.2 mg/mL、1:100希釈)、IL-17A(FITC標識、0.5 mg/mL、1:100希釈;APC標識、0.2 mg/mL、1:100希釈)、IL-4(APC標識、0.2 mg/mL、1:100希釈)、およびIFNγ(APC標識、0.2 mg/mL、1:100希釈;PE標識、0.2 mg/mL、1:100希釈)を暗所で30分間静置します。

>表1:使用済みサイトカインと抗体。

秒 秒 の の シリーズ

名前	ストック濃度	作業集中力	希釈	500 μL 染色バッファー中の容量
CD4-PerCp	0.2 mg/mL	2.8 μg/mL	1分71	7 μL
CD44-APCの	0.2 mg/mL	2.4 μg/mL	1分83	6 μL
CD25-PE	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100	5 μL
CD62L-FITC	0.5 mg/mL	10 μg/mL	1:50	10 μL
GM-CSF-PE	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IL-17A-FITC	0.5 mg/mL	5 μg/mL	1:100
IL-17A-APCの	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IFNγ-APCの	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IFNγ-PE	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IL-4-APCの	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
CD4-FITC	0.5 mg/mL	5 μg/mL	1:100
IL-7	20 μg/mL	2 ng/mL	1:10000
アンチCD28	0.5 mg/mL	1 μg/mL	1:500
反IFNγ	1 mg/mL	10 μg/mL	1:100

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMIの1640	バイオウエスト	L0500-500
FBSヒート不活性化	山羊座	FBS-HI-12Aの
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140122
10倍PBS	一塁	BUF-2040-10	滅菌水で1x PBSに希釈
EDTAの	一塁	BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACKバッファ	バイオレジェンド	420301	滅菌水で希釈
セルストレーナー	SPLライフサイエンス	93070
CD4マイクロビーズ	ミルテニーバイオテック	〒130-049-201
2-メルカプトエタノール	シグマ	M7522
LSカラム	ミルテニーバイオテック	〒130-042-401
マグネットスタンド	ミルテニーバイオテック	〒130-042-303
1mlシリンジ	テルモ	SS+01T
遠心機	エッペンドルフ	エッペンドルフ5810R
ソニー SY3200 セルソーター	ソニー	ソニー SY3200 セルソーター
50mlコニカル遠心チューブ	グライナーバイオワン	210261
15mコニカル遠心チューブ	グライナーバイオワン	188271
FACSチューブ	コーニング	352054
マウス抗CD4 PerCP-eFluor 710	eバイオサイエンス	〒46-0041-82
PE標識抗マウスCD25(IL-2Ra, p55)	eバイオサイエンス	〒12-0251-82
抗ヒト/マウスCD44 APC	eバイオサイエンス	17-0441-82
抗マウスCD62L FITC	eバイオサイエンス	11-0621-85
ノイバウアー改良型計数室	マリエンフェルド	640010
ハイクロントリパンブルーソリューション	GEヘルスケア ライフサイエンス	01 SV30084月
顕微鏡	ニコン	ニコンエリプス TS100
精製された抗マウスCD3e抗体	バイオレジェンド	100314
精製ハムスター抗マウスCD28	BDバイオサイエンス	553295
精製ラット抗マウスIFNγ	eバイオサイエンス	16-7312-85
精製された抗マウスIL-4	バイオレジェンド	504102
組換えマウスIL-7タンパク質	研究開発体制	407ミリリットル
PMAの	メルクミリポア	19〜144
イオノマイシン	シグマ	I0634
GolgiPlugタンパク質輸送阻害剤	BDバイオサイエンス	51-2301KZ
細胞内固定&透過化バッファーセット	eバイオサイエンス	〒88-8824-00
マウス駆逐菌GM-CSF PE	eバイオサイエンス	12-7331-82
FITC抗マウスIL-17A	バイオレジェンド	506908
APC抗マウスIFN-γ	バイオレジェンド	505810