マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 脳の解離と磁気ミクログリアの分離

>注:すべての細胞操作と再懸濁は、1,000μLのピペットで細心の注意を払って実行する必要があります。高い機械的作用を加えると、ミクログリア細胞が活性化または死滅する可能性があります。

1. 表1に従って、解離混合物を含む解離チューブごとに12個の脳片(~1.2g)を移す。24匹の子犬の場合、4本のCチューブが必要になります(図1A-B)。
2. Cチューブを解離器に配置します(加熱モードの場合)。製造元の指示に従って、機器で最適化されたNTDKプログラムを開始します(図1D)。
3. 300 x gで20秒間(4°C)遠心分離し、すべての細胞を収集します。1,000 μLのピペットで3回上下にピペッティングして、機械的な解離を完了します(図1E)。
4. 細胞を4本の15 mLチューブ+ストレーナーに移します。Ca²⁺およびMg²⁺(HBSS+/+)を含む1x Hanks'Balanced Salt Solution(HBSS)10 mLでストレーナーをすすぎます(図1F)。
5. 300 x gで10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10 mLのHBSS+/+で慎重に再懸濁します(図1G)。
6. 300 x gで10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを6 mLのソーティングバッファー(1x PBS + 0.5% BSA)で慎重に再懸濁します(図1H)。
7. 300 x gで10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。チューブあたり200 μLのCD11b-マイクロビーズ溶液を加え、慎重に再懸濁します(図1I)。
8. チューブを4°Cで15〜20分間インキュベートし、ペレットを6 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(図1I-J)。
9. 300 x gで10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを8 mLの選別緩衝液で慎重に再懸濁します(図1K)。
10. セパレーターのPOSSELプログラム(資料表を参照)に従って、8列を準備します。カラム上で細胞を1 mL×1 mLに移します。すべての細胞が通過するのを待ってから、別のmLを追加します。1 mLのソーティングバッファー(図1L)を入れた滅菌溶出プレート上でCD11b+細胞を溶出します。
11. CD11b+細胞を新しい50 mLチューブにプールします(図1M)。
12. 300 x gで10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10 mLの冷たいミクログリア培地(マクロファージ無血清培養培地(SFM)+ 1%のペニシリン-ストレプトマイシン(P / S))で慎重に再懸濁します(図1N)。
13. CD11b+細胞を数えます。P8では、脳あたり~650,000個の細胞が得られるはずです
    手記：本プロトコルでは、細胞を自動セルカウンターを用いてカウントした(材料の表を参照)。
14. 冷ミクログリア培地で細胞を最終濃度650,000〜700,000細胞/mLまで再懸濁し、細胞培養プレートに分注します
    手記：6ウェルプレートはウェスタンブロット用です(ウェルあたり2 mL)。12ウェルプレートはRT-qPCR分析用(1ウェルあたり1 mL)、96ウェルプレートは食作用アッセイ用(250 μL/ウェル)です。

表1:解離混合物の調製。

図1:脳の解離とミクログリア細胞の分離の概略図。(A-C)P8マウス脳を解剖し、嗅球と小脳を切除した後、脳は最初にHBSS+/+のシャーレに移され、次に解離混合物を含む解離チューブに移されました。Cチューブを解離器(加熱モード)に配置し、NTDKプログラムを開始しました(D)。(E)プログラムの最後に、チューブを300 x gで4°Cで20秒間遠心分離しました。その後、1,000 μLのピペットで3回上下にピペッティングすることで解離を完了しました。(F)次いで、細胞を70μmの15mLチューブ+ストレーナーに移し、10mLのHBSS+/+で洗浄した。次に、サンプルを300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを10 mLのHBSS+/+で再懸濁しました。(H)チューブを再び300 x gで4°Cで10分間遠心分離しました。上清を除去し、次にペレットを6 mLの選別緩衝液に再懸濁しました。(I)チューブを300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去し、CD11b-マイクロビーズ(200 μL)溶液を添加した。チューブを4°Cで15〜20分間インキュベートした後、6mLの選別緩衝液(J)に再懸濁し、300×gで4°Cで10分間遠心分離した。(L) 次に、セパレーターでPOSSELプログラムを起動してカラムを準備します。細胞をカラム上で1 mL×1 mLに移し、CD11b細胞を1 mLのソーティングバッファーを含む滅菌溶出プレート上で溶出しました。(M)CD11b細胞を新しい50mLチューブにプールし、300×gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去しました。(N)ペレットを最後のステップで10mLの冷たいミクログリア培地に注意深く再懸濁しました。細胞をカウントし、ミクログリア培地で最終濃度650,000〜700,000細胞/mLまで希釈し、細胞培養プレートに分注しました。