マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

要約

出典: Bokobza, C. et al., Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (2022)

このビデオでは、磁気活性化細胞ソーティングを使用してマウスの子犬の脳からミクログリアを含むCD11b細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。脳組織をホモジナイズして単一細胞懸濁液を得ると、抗CD11b抗体でコーティングされたマイクロビーズとインキュベートした後、磁気カラムベースの分離によりCD11b+細胞集団を精製します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 脳の解離と磁気ミクログリアの分離

>注:すべての細胞操作と再懸濁は、1,000μLのピペットで細心の注意を払って実行する必要があります。高い機械的作用を加えると、ミクログリア細胞が活性化または死滅する可能性があります。

1. 表1に従って、解離混合物を含む解離チューブごとに12個の脳片(~1.2g)を移す。24匹の子犬の場合、4本のCチューブが必要になります(図1A-B)。
2. Cチューブを解離器に配置します(加熱モードの場合)。製造元の指示に従って、機器で最適化されたNTDKプログラムを開始します(図1D)。
3. 300 x gで20秒間(4°C)遠心分離し、すべての細胞を収集します。1,000 μLのピペットで3回上下にピペッティングして、機械的な解離を完了します(図1E)。
4. 細胞を4本の15 mLチューブ+ストレーナーに移します。Ca²⁺およびMg²⁺(HBSS+/+)を含む1x Hanks'Balanced Salt Solution(HBSS)10 mLでストレーナーをすすぎます(図1F)。
5. 300 x gで10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10 mLのHBSS+/+で慎重に再懸濁します(図1G)。
6. 300 x gで10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを6 mLのソーティングバッファー(1x PBS + 0.5% BSA)で慎重に再懸濁します(図1H)。
7. 300 x gで10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。チューブあたり200 μLのCD11b-マイクロビーズ溶液を加え、慎重に再懸濁します(図1I)。
8. チューブを4°Cで15〜20分間インキュベートし、ペレットを6 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(図1I-J)。
9. 300 x gで10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを8 mLの選別緩衝液で慎重に再懸濁します(図1K)。
10. セパレーターのPOSSELプログラム(資料表を参照)に従って、8列を準備します。カラム上で細胞を1 mL×1 mLに移します。すべての細胞が通過するのを待ってから、別のmLを追加します。1 mLのソーティングバッファー(図1L)を入れた滅菌溶出プレート上でCD11b+細胞を溶出します。
11. CD11b+細胞を新しい50 mLチューブにプールします(図1M)。
12. 300 x gで10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10 mLの冷たいミクログリア培地(マクロファージ無血清培養培地(SFM)+ 1%のペニシリン-ストレプトマイシン(P / S))で慎重に再懸濁します(図1N)。
13. CD11b+細胞を数えます。P8では、脳あたり~650,000個の細胞が得られるはずです
    手記：本プロトコルでは、細胞を自動セルカウンターを用いてカウントした(材料の表を参照)。
14. 冷ミクログリア培地で細胞を最終濃度650,000〜700,000細胞/mLまで再懸濁し、細胞培養プレートに分注します
    手記：6ウェルプレートはウェスタンブロット用です(ウェルあたり2 mL)。12ウェルプレートはRT-qPCR分析用(1ウェルあたり1 mL)、96ウェルプレートは食作用アッセイ用(250 μL/ウェル)です。

表1:解離混合物の調製。

名 名 名 名 名 名 名 年 年

解決	Cチューブ1本分(μL)	C字管4本分(μL)
バッファX	2850	11400
エンザイムP(パパイン)	75	300
酵素A(DNAse)	15	60
バッファ Y	30	120
トータル	2970	11880

結果

図1:脳の解離とミクログリア細胞の分離の概略図。(A-C)P8マウス脳を解剖し、嗅球と小脳を切除した後、脳は最初にHBSS+/+のシャーレに移され、次に解離混合物を含む解離チューブに移されました。Cチューブを解離器(加熱モード)に配置し、NTDKプログラムを開始しました(D)。(E)プログラムの最後に、チューブを300 x gで4°Cで20秒間遠心分離しました。その後、1,000 μLのピペットで3回上下にピペッティングすることで解離を完了しました。(F)次いで、細胞を70μmの15mLチューブ+ストレーナーに移し、10mLのHBSS+/+で洗浄した。次に、サンプルを300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを10 mLのHBSS+/...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ血清アルブミン	ミルテニーバイオテック	〒130-091-376
CD11b (ミクログリア) マイクロビーズ, h, m	ミルテニーバイオテック	〒130-093-634
D-PBS(10倍)	サーモサイエンティフィック	14200067
Falcon Cell culture 12ウェルプレート、平底+蓋	ダッチャー	353043
ファルコンチューブ50 mL	ファルコンチューブ50 mL	352098
神経組織解離キット - Papain	ミルテニーバイオテック	〒130-092-628
ヌクレオカウンター NC-200	ケモメテック
Nun EZFlipトップコニカル遠心分離管	サーモサイエンティフィック	362694
OPTILUXペトリ皿 - 100 x 20 mm	ダッチャー	353003
gentleMACS Cチューブ(4 x 25チューブ)	ミルテニーバイオテック	〒130-096-334
gentleMACS オクトディスソシエータ ヒーター付き	ミルテニーバイオテック	〒130-096-427
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)+ CaCl2 + MgCl2 10x	サーモサイエンティフィック	14065049
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	サーモサイエンティフィック	15140122
マクロファージ-SFM 無血清培地	サーモサイエンティフィック	12065074
MACS BSAストックソリューション	ミルテニーバイオテック	〒130-091-376
MACS SmartStrainers(70μm)、4 x 25個	ミルテニーバイオテック	130-110-916
MultiMACS Cell24セパレーター	ミルテニーバイオテック
Multi-24カラムブロック	ミルテニーバイオテック	〒130-095-691