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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. マウスとDSSの準備
- ノックアウト(α-gustducin-/-)マウスと年齢、性別、体重が一致した野生型コントロール(α-gustducin+/+)C57BL/6マウスを個別に清潔なケージに保管してください
手記： ノックアウトマウスは、20世代以上にわたってC57BL/6マウスと戻し交配されており、ほぼ100%のC57BL/6遺伝的背景を持っています。
- 30 gのデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)粉末を1 Lのオートクレーブ水に溶解します。溶液が透明になるまで混合して、最終作業濃度が3%(w / v)であることを確認します
手記：DSS溶液は、室温で最大1週間、または使用するまで4°Cで保存できます。
>2. マウスにおけるDSS大腸炎の誘導と評価
- 各マウスの初期体重を量り、記録します。マウスを個別に標準的なプラスチック製ケージに入れ、ケージにラベルを付けます。
- 通常の飲料水を3%DSS溶液に交換し、マウスの両方のグループが自由にアクセスできる合計7日間
。
- マウスの体重を測定し、DSS溶液の消費量を記録し、DSS投与中に各マウスの便を毎日収集して検査します。下痢と直腸出血の重症度を観察し、これをDSS誘発性疾患指数に変換します。
- 実験中、初期体重と比較した体重減少の割合と疾患指数を計算して、大腸炎の症状を評価します.
手記： 疾患指数は、下痢と直腸出血の観察結果を組み合わせて採点され、0(正常な便、血液なし)、1(軟便、血液なし)、2(軟便、少量)、3(非常に軟便、中程度の出血)、および4(水様便、重大な出血)として定義されます。疾患指数は、マウスごとに毎日分析されます。
- 7日間のDSS治療の終わりまでに、子宮頸部脱臼によってマウスを犠牲にし、残りの実験を進めます。
>3. 組織サンプルの準備
- マウスを仰臥位に置き、腹部の皮膚を70%エタノールで洗浄します。腹部に長さ3cmの正中線切開を小さなハサミで行い、腹腔を露出させます。
- 一対の鉗子を使用して脾臓を他の組織から慎重に分離し、次に脾臓を取り出してそのサイズを測定します。
- 鉗子で結腸を特定して持ち上げ、周囲の腸間膜から分離します。盲腸と直腸が見えるまで結腸全体を引き出します。
- 結腸を大腸盲縁と骨盤の深部で横断して結腸を分離し、それぞれ近位結腸と遠位結腸を解放します。次に、分離された結腸の長さを測定して記録します。解剖処置中に結腸組織を傷つけないように注意してください。
- 強制針を備えた10mLのシリンジを使用して、10mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で結腸を洗い流し、溶出液が完全に透明になるまで糞便と血液を取り除きます。
- 組織学的同定のために、組織サンプルを近位、中位、遠位の3つの部分に均等に分割します。次に、組織を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで一晩固定します。