エレクトロポレーションによる細菌エフェクタータンパク質の哺乳動物細胞への導入

要約

出典:Sontag, R. L. et al., Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、エレクトロポレーションによる細菌のエフェクタータンパク質の哺乳類細胞への導入を実演しています。細菌のエフェクタータンパク質の細胞内局在は、特異的な蛍光色素標識抗体による染色後の共焦点顕微鏡法によって検出されます。

プロトコル

1. エレクトロポレーション

1. 400 μlの細胞懸濁液をあらかじめ冷却したキュベットに入れ、選択したタンパク質20 μgをキュベットに加えます (50 μg/ml)。
2. キュベットを優しく~10回フリックして、細胞を傷つけずに混合します。手記： キュベットは、完全に混合するために数回反転させることもできますが、細胞の損傷を避けるためにピペットを上下させたり、渦を巻いたりしないでください。
3. キュベットの外側をペーパータオルまたは他のワイパーで乾かし、エレクトロポレーターでの電気アークを防ぎます。
4. 0.3 kV で 1.5-1.7 ミリ秒のエレクトロポレート サンプル注: これはこの研究で一般的でした。
5. エレクトロポレーションの直後に、キュベットを軽く~10回フリックして完全に混合します。

2. セルのめっき

1. エレクトロポレーションセルを装着したキュベットを、リカバリープレートに入れる準備ができるまで氷上に保存します。
2. ほとんどのダウンストリーム解析では、あらかじめ温めたNGMで細胞を1倍洗浄し、無関係なエフェクタータンパク質を除去します。
   1. 分析用の細胞を取り出し、3〜5 mLのNGMに懸濁します。
   2. 900 x gで4分間遠心分離することにより、細胞をペレット
   化します。
   3. 希望のプレートサイズ(例:35 mmディッシュの場合は2 mL)のNGMに適切な容量で再懸濁します。
3. ダウンストリーム解析のために適切な量のセルを削除します。
   1. 例1:顕微鏡分析のためにガラス底の皿にプレートします。
   2. 例2:アフィニティー精製などのタンパク質分析のために、細胞培養プラスチックにプレートします。
4. 加湿した95%空気/5%CO₂雰囲気、37°Cで少なくとも4時間、平衡化したプレートで細胞を回復させます。

3. 顕微鏡分析

1. 固定/免疫蛍光染色
   1. 4時間の回復期間の後、滅菌PBSで細胞を1回洗浄します。
   2. 細胞を100%メタノールに室温で2分間固定します。細胞を完全に覆うのに十分なメタノールを使用します(例:35 mmディッシュの場合は2 mL)。
   3. 滅菌PBSで3回洗浄します。
   4. 0.4% Triton X-100をPBS中で15分間細胞を透過処理します。たとえば、直径35mmのプレートには1mlを使用します。
      1. Triton X-100の透過化の長さと強度は、標的タンパク質のエピトープと位置に応じて調整してください。手記： 最良の結果は、各ターゲットについて経験的に決定する必要がありますが、上記の条件はほとんどのサイトゾルターゲットにとって適切であるべきです。
   5. PBS中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)をRTで1時間ブロックします。たとえば、直径35mmのプレートには1mlを使用します。
   6. PBSで3回洗ってください。
   7. 一次抗体を抗体結合溶液(0.1% Triton X-100および1% BSA in PBS)で4°Cで一晩、穏やかに揺さぶりながらインキュベートします。たとえば、直径35mmのプレートには0.5mlを使用します。
      1. 抗体希釈に関するメーカーの推奨に従ってください。手記：例えば、ストレプトアビジン結合ペプチドタグ(SBPタグ)抗体は1:1,000希釈で使用し、PKN1抗体は1:200希釈で使用しました。
   8. PBSで4回洗います。
   9. 適切な蛍光標識二次抗体と抗体結合溶液中で、光から保護された室温で1時間インキュベートします。
      1. たとえば、Alexa 488またはAlexa 647を室温で1時間使用します。
         1. 抗体希釈に関するメーカーの推奨に従ってください。(例えば、この研究では約1:1,000)。
      2. 必要に応じて、Alexa 647またはDAPIに結合した5 μMの小麦胚芽凝集素(WGA)を室温で1時間、室温で1時間加えます。
   10. PBSで5回洗浄し、4°Cで保存し、イメージングの準備が整うまで光から保護します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン EDTA 溶液	セルグロ	25-050-CL
0.4cmギャップ使い捨てエレクトロポレーションキュベット	バイオ・ラッド	165-2088
メタノール100%	任意	該当なし	可燃性、有毒
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A4919の
細胞計数装置 - 血球計算盤またはコールターカウンター	ベックマン・コールター	モデルZ1
細胞培養インキュベーター	任意	該当なし	37°Cで95%空気/5%CO2雰囲気を加湿
細胞培養プラスチック	任意	該当なし	細胞培養フラスコ/プレート、ピペット、チューブ、ゴムポリスマン
ダルベッコによるイーグルズミディアム(DMEM)の改造	セルグロ	10-013	37°Cまで温めます
エレクトロポレーター	バイオ・ラッド	大腸菌パルサー
ウシ胎児血清(FBS)	セルグロ	35-016-CV
蛍光共焦点顕微鏡	ジース	モデルLSM 710
顕微鏡用ガラス底皿	ウィルコ・ウェルズ	HBStの- 3522
HeLa細胞株	ATCCの	ATCC CCL-2
ミニマルエッセンシャルメディウム(MEM)	セルグロ	10-010	37°Cまで温めます
その他の蛍光染色剤(WGA、DAPI)と退色防止剤の併用	任意	該当なし
ペニシリン/ストレプトマイシン	セルグロ	30-002-CL
RAW 264.7細胞株	ATCCの	TIB-71
目的ターゲットに対する一次抗体	任意	該当なし
フルオロフォアに結合した二次抗体	任意	該当なし
リン酸緩衝生理食塩水	任意	該当なし	4°Cまで冷やす
滅菌リン酸緩衝生理食塩水	任意	該当なし	37°Cまで温めます
コニカルチューブを受け入れることができるテーブルトップ遠心分離機(スイングバケットが望ましい)	任意	該当なし
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	T8585	刺激性、毒性