動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 実験室条件下でのマラセチアの栽培
>注:このプロトコールに使用するすべての試薬と培地は、特に明記されていない限り、室温(RT、20〜25°C)で保管してください。
- マラセチアの成長のために液体変性ディクソン(mDixon)培地を準備します。500 mLの液体mDixon培地を調製するには、18 gの麦芽抽出物、10 gの乾燥した牛胆汁、5 mLのTween-40、3 gのペプトン、1 mLのグリセロール、および1 mLのオレイン酸を500 mLの蒸留H2O(dH2O)に溶解します。HClとオートクレーブで培地をpH 6に調整します。メディアはRTで保管してください。
- オートクレーブ前に、500 mLのmDixon培地に7.5 gの寒天を添加して、mDixon寒天プレートを調製します。オートクレーブ後、ステアリングバーと磁気加熱プレートを使用してmDixon寒天をゆっくりと冷却し、冷却中に媒体が部分的に固まらないようにします。
- 寒天が50〜60°Cに冷えたら、液体を層流フードのシャーレに分注し、RTで一晩乾燥させます
手記：寒天プレートは、蒸発を防ぐために包んで逆さまにしておくと、4°Cで数週間保存できます。
- Malassezia分離物を入手し、プロバイダーが入手した指示に従ってMalasseziaの凍結乾燥ストックを復活させます。
- 滅菌済みの100 mL三角フラスコに10 mLの液体mDixon培地を、プロバイダーが入手した指示に従って、復活したマラセチア懸 ?? 液を接種します。.30°C、180rpmの振とうインキュベーターで培養物をインキュベートします。
- クリーム色と濁りの出現をチェックすることにより、マラセチア文化の成長を定期的に検査します。成長速度はマラセチアの種と株によって異なり、マラセチアが凍結乾燥ストックから新たに復活した場合、特に遅くなる可能性があります。.(図1A)。
- mDixon培地で密に増殖したMalassezia培養物の3部と滅菌99%グリセロール1部を混合することにより、グリセロールストックを調製します。マラセチア/グリセロール混合物を滅菌スクリューキャップチューブに分注し、-80°Cで保存します。
- in vitroでの増殖には、mDixonの液体培養物または凍結グリセロールストックからのMalasseziaをmDixon寒天プレート(4°CからRTに持ち込む)に接種ループを使用してプレート化します。
手記：冷たいmDixon寒天は真菌の増殖を阻害するため、使用前にmDixon寒天プレートを4°CからRTに移してください。
- 寒天プレートをMalasseziaと逆さまにして、30°CのaN(非振とう)インキュベーターでインキュベートします。Malasseziaコロニーの成長を定期的に検査します。
注:mDixon寒天プレート上のマラセチアコロニーは3〜5日以内に現れ、クリーム色、くすみ、滑らかで、凸状の隆起があります(図1B)。
- MalasseziaコロニーをmDixon寒天プレートにRTで~2週間保存します。その後、1.7に記載されているように、凍結グリセロールストックからMalasseziaをストリーキングすることにより、新しいmDixon寒天プレートを調製します。
2. マウスの実験的マラセチア感染のための接種材料の調製
- 滅菌済みの100 mL三角フラスコに10 mLの液体mDixon培地を、mDixon寒天プレートから3〜5個の個別のMalasseziaコロニーとともに接種します(ステップ1、図1Bを参照)。
- Malassezia培養物を30°C、180rpmで48~96時間インキュベートし、培養物がクリーム色で濁るまで(図1A)。
手記：マラセチアの成長に必要な時間は、マラセチアの種と株、および接種に使用される真菌の量によって異なります。
- Malassezia培養液2 mLを滅菌済みの2 mLマイクロ遠心チューブに移し、10,000 x gで1分間遠心分離します。
- 上清を捨て、ペレットを1 mLのリン酸緩衝塩溶液(PBS)に懸濁して洗浄します。再度、10,000 x gで1分間遠心分離します。
- 洗浄後、激しいピペッティングによりペレットをPBS1 mLに懸濁し、分光計を使用して600 nm(ODA600)の溶液の光学密度を測定します。Malassezia懸濁液をPBSで20〜50倍に希釈してOD測定を行い、読み取り値が0.1〜1.
であることを確認します
手記：Malasseziaの3日間培養液の密度は、一般に、Malasseziaの種と菌株、および培養液の接種に使用される酵母細胞の数に応じて、15〜30 ODA600の間で変動します(ステップ2.1)。Malasseziaは凝集体を形成する傾向があるため、懸濁液の均一性を確保するためには、精力的なピペッティングが必要です。
- 4 ODA600の密度に対応するPBS中のMalassezia懸濁液の量を滅菌2mLチューブに分注します。.感染する動物1匹につき1本のチューブを用意してください。
- マラセチアを含むチューブを10, 000 x gで1分間遠心分離します。
- 上清を捨て、マラセチアペレットを200μLの天然オリーブオイル(2 ODA600酵母細胞/100μLオリーブオイルに相当)に懸濁します。
手記：オリーブオイルは、マラセチアが親油性で脂質依存性の酵母であるため、マラセチアによる皮上感染に適した媒体であることがわかりました。オリーブオイルはPBSよりも肌によく吸収されます。ただし、マラセチアをオリーブオイルで懸濁するのは簡単ではないことに注意してください。ボルテックスにより、マラセチア/オリーブオイル懸濁液を改善します。懸濁液は、感染に使用されるまでRTで保管してください。
- 対照動物の模擬感染のためにオリーブオイルだけでチューブを準備します。
3. マウスのマラセチア感染
- 雌のC57BL/6マウスは生後6〜8週齢でオーダーし、実験動物施設で少なくとも1週間は順応させてください。感染していない対照群を含む、グループごとに3〜5匹のマウスを計算します。
- 1.3 mg / mLのキシラジンと6.5 mg / mLのケタミンをPBSに含む滅菌麻酔カクテルを準備します。麻酔する動物の数に応じてカクテルの量を調整します。
腹腔- 内に麻酔カクテルの10μL / g体重を注射して動物に麻酔をかけます(体重1kgあたり65mgのケタミンと13mgのキシラジンに対応)、麻酔をかけた動物を37°Cの加熱パッドに置きます
手記：指示された用量では、動物は通常30~60分間麻酔をかけられたままになります。
- 鉗子で後足をつまんで反射神経をチェックし、動物が完全に麻酔をかけられていることを確認します。
- 麻酔中の脱水症状を防ぐために、アイクリームを目に塗ります。
- 必要に応じて、キャリパー(0〜5 mmの範囲)を使用して両耳の耳の厚さを測定します。各耳の2つの異なる領域を測定し、耳あたりの平均耳の厚さを計算します。
手記：耳の厚さの測定はオプションであり、研究課題によって異なります。しかし、耳の厚さを皮膚の炎症の測定値として使用する場合は、感染前にベースラインの耳の厚さを測定する必要があります。(ステップ 4 を参照)。
- 必要に応じて、軽度のテープストリッピングによって背側の耳の皮膚の表皮バリアを破壊します:手動で小さなテープを皮膚に貼り付け、再度剥がします。各ラウンドで新しいテープを使用して5ラウンド連続で繰り返します.
注:マラセチアは、動揺していない皮膚と比較して、バリアが破壊された皮膚でより顕著な皮膚炎症を誘発します(図2A)。
- 滅菌ピペットを使用して、マラセチア/オリーブオイル懸濁液100μL(2 ODA600)を各耳の背側に局所的に塗布します。.オリーブオイルのみで処理された動物の対照群(ビヒクル処理対照群)を含めます。
手記：Malassezia/オリーブオイル懸濁液を激しく渦巻いて、塗布直前に均質なMalassezia懸濁液を確保します。
- 麻酔をかけた動物は、回復の兆候(ひげの動き、呼吸数の増加など)が現れるまで低体温を避けるために、加熱パッドの上に置いておきます。
- 200 μLの滅菌済みで予熱済みの2%グルコース溶液を皮下注射し、血管の襞に注射して、代謝と水分補給をサポートします。
手記：滅菌済みの2%グルコース溶液を調製するには、1 mgのグルコースを50 mLのPBSに溶解し、0.2 μmフィルターを使用してろ過します。溶液は4°Cで保存できます。
- 動物をケージに戻します。
>4. マラセチアによる皮膚炎症の解析
>注:この手順では、皮膚の炎症のパラメータとして機能する感染中のマラセチア誘発性の耳の腫れの分析について説明します。真菌による耳の腫れを分析するための前提条件は、テープストリッピングおよび/または感染の前にベースラインの耳の厚さを測定することです(ステップ3.5)。
- マラセチア感染動物の短期麻酔用のイソフルランチャンバーを準備し、対照動物
。
- 一度に1匹ずつチャンバーに移し、動物が完全に麻酔されるのを待ちます
手記：適切な麻酔の兆候には、全身のリラクゼーションや、ゆっくりとした激しい(脇腹の)呼吸が含まれます。イソフルランへの長時間の曝露は致命的となる可能性があるため、麻酔を注意深く監視してください。.
- 動物をチャンバーから取り出し、ティッシュの上に置きます。
- キャリパーを使用して耳の厚さを測定します(範囲0〜5 mm)。各耳の2つの異なる領域を測定し、耳あたりの平均厚さを計算します(手順3.5を参照)。
- 動物をケージに戻します。
手記：イソフルラン麻酔は非常に短命で、動物はイソフルランチャンバーから取り出した後~30秒以内に回復します。
- テープの剥離および/または感染前に測定された平均ベースライン耳の厚さを、感染後の各時点で測定された平均耳の厚さから差し引いて、耳の厚さの増加を計算します。
- 計算された値を、耳の厚さの増加としてプロットするか、または、各動物または動物のグループの経時的な耳の総厚さとしてプロットします(図2B)。
5. 感染した皮膚の真菌負荷の解析
- 回収する各耳に、dH2O中の0.5 mLの滅菌0.05%ノニデットP40(NP40)とオートクレーブ滅菌鋼球(直径5 mm)を含む滅菌2 mLマイクロ遠心チューブを準備します。
- 精密天びんを使用してチューブの重量を量り、正確な重量を書き留めます。
- CO2窒息によってマウスを安楽死させます。
- 基部の耳を取り外し、ステップ5.1〜5.2で説明されているように、dH2O中に0.5 mLの滅菌0.05%NP40を含むチューブに移します。.
- 耳組織を含むチューブの重量を量り、臓器のあるチューブの重量から臓器のないチューブの重量を差し引くことにより、各サンプルの実際の重量を計算します。
- 組織ホモジナイザーを使用して、耳の組織を25Hzで6分間均質化します。組織が十分に均質化されていることを確認してください。
- 各サンプル100μL(各ホモジネートの1/5に相当、希釈係数= 5)をmDixon寒天プレートにプレートし、30°Cのインキュベーターでプレートを逆さまにインキュベートします
手記：メッキされるホモジネートの量は、予想される真菌の負荷に応じて調整する必要があります。簡単に列挙できるように、プレートあたり少なくとも10コロニーから250コロニー以下を得るのに十分なホモジネートをプレートするようにしてください。オプションで、サンプルごとに複数のプレートを、異なる希釈量のホモジネートでプレート化します。
- マラセチアのコロニーの成長を定期的に検査してください。
手記：コロニーは通常2〜3日後に見えるようになります。マラセチアのコロニーが成長するのに必要な時間は、マラセチアの種と株によって異なります。
- プレートあたりのコロニーを数えます。
- コロニー形成単位、CFU/g組織の数を次の式を使用して計算します:
CFU/g組織=(コロニー数/プレート)×(希釈係数)/(皮膚サンプルの重量(g)
手記：おおよその最小検出限界は、次の式を使用して評価できます:最小検出限界=(1コロニー/プレート)×(希釈係数)/(すべての皮膚サンプルの平均重量(g))。
- 真菌荷重は通常、対数スケールでプロットされます(図2C)。
