宿主上皮細胞への細菌付着におけるビトロネクチンの役割を研究するためのアッセイ

要約

出典:Singh, B. et al., Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance. J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、宿主上皮細胞へのインフルエンザ菌の付着におけるビトロネクチンの役割を研究するためのアッセイを実演します。

プロトコル

1. 細菌の上皮細胞へのVn依存的な付着に関する研究

1. A549細胞(II型肺胞上皮細胞)を、10%(vol/vol)のウシ胎児血清(FCS)(完全培地)と5 μg/mLのゲンタマイシンを添加したF12培地を添加した75 cm²組織培養フラスコで培養します。インキュベーター内でフラスコを5% CO₂ with 37 °Cで 3 日間インキュベートし、80% コンフルエントになるまでインキュベートします(コンフルエント度は、倒立顕微鏡を使用して細胞の表面被覆を視覚化することで推定できます)。次の4つのステップでは、アッセイ用の上皮細胞の調製方法について説明します。
   1. フラスコ内の細胞単層を20mLのPBSで2回、穏やかに渦巻かせて洗浄します。フラスコ表面から細胞を剥離するには、2 mLの細胞剥離酵素溶液を加え、フラスコを37°Cで5分間インキュベートします。ピペットを数回上下させて、細胞の塊を分散させます。
   2. 18 mLのF12完全培地をフラスコに加え、細胞懸濁液全体を50 mLの滅菌Falconチューブに移します。細胞懸濁液を200 x gでRTで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットを10 mLのF12完全培地に再懸濁します。
   3. 細胞懸濁液10μLを取り出してエッペンドルフチューブに入れ、次に90μLのトリパンブルー溶液を加えます。カバースリップを貼った後、サンプルを血球計算盤(深さ0.1mm)にロードします。
   4. 領域A、B、C、およびD(各フィールドは16個の正方形で構成され、各正方形の面積は0.0025 mm²)のすべての生存可能な細胞を数え、平均細胞数([A + B + C + D]/ 4)を計算します。次の式を使用して、ミリリットルあたりのセル数を計算します:
      生細胞数/mL = 平均細胞数 × 10⁴ × 希釈係数.
      手記： ここで、希釈係数は10です。
   5. 5 μg/mL ゲンタマイシンを含む完全培地を使用して、細胞懸濁液を 5.0 x 10³ 細胞/mL に希釈します。500 μLの細胞懸濁液を24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに分注します。プレートを5%_CO2中で37°Cでインキュベートし、細胞が90%コンフルエントになるまでインキュベートします。
2. 細菌感染する前に、培地をウェルから取り出し、F12培地(FCSなし)を加え、37°Cで一晩インキュベー
トします。
3. RTで細胞単層を500 μLのPBSで3回洗浄し、プレートを氷の上に置き、10 μg/mLのVnを含む100 μLの予冷済みF12培地を加えます。コントロールウェルの場合は、F12培地のみを追加します。
4. インキュベーション後、ピペッティングで溶液を廃棄し、室温で細胞層を1 mLのPBSで2回洗浄します。
5. 10 μg/mL NAD とヘミンを 37 °C で添加し、200 rpm で振とうした脳心注入 (BHI) 培地中の Culture Hif Clinical 分離株。Luria-Bertani培地を使用して大腸菌を培養します。中対数相(OD600 = 0.3)でHifを採取し、1%(w / v)のウシ血清アルブミン(BSA)(ブロッキングバッファー;PBS-BSA)です。懸濁液を10⁹ CFU/mLに調整します。新たに培養したHif M10の培養物をF12培地(2×10⁸ CFU/mL)に再懸濁します。この細菌懸濁液を各ウェルに100 μL加え、プレートを37°Cで2時間インキュベートします
   手記： 各ウェルには、約2 x 10⁵個のA549細胞が含まれています。感染については、2 x 10⁷ 細菌 CFU を添加し、感染の多様性 100 に対応しました。
6. ピペッティングで培地を取り出し、A549上皮細胞をPBSで3回洗浄します。細胞剥離溶液50 μL/ウェルを加え、プレートを37°Cで5分間インキュベー
トします。
7. 次に、ウェルあたり50 μLのF12完全培地を添加して、酵素反応を停止します。上皮細胞(≈100 μL[すなわち、全容量])を各ウェルから4つのガラスビーズが入った6 mLガラス管に移します。RTで細胞を2分間ボルテックスして溶解します。
8. 10 μLのライセートを990 μLのF12培地に加えて、10 μLの細胞ライセートを100倍に希釈します。希釈したサンプル10μLをチョコレート寒天プレートにプレートします。
9. チョコレート寒天プレートを37°Cで一晩インキュベートし、コロニーを数えます。各コロニーは 1 つの CFU を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5 mLポリスチレン丸底チューブ	BDファルコン	〒60819-138	12 × 75 mmスタイル
5% CO2供給インキュベーター	サーモサイエンティフィック	BBD6220
6 mLポリスチレン丸底チューブ	VWRの	89000から478	キャップ付き12×75mmスタイル
24ウェルプレート	BDファルコン	08-772-1H	細胞培養グレード
75 cm2組織培養フラスコ	BDファルコン	BD353136	発明
A549 ヒト細胞株	シグマ・アルドリッチ	86012804から1VL
細胞剥離酵素(アキュターゼ)	シグマ・アルドリッチ	A6964-500ミリリットル	細胞培養グレード
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A2058(英語版)	細胞培養に適しています
F12ミディアム	シグマ・アルドリッチ	D6421	細胞培養グレード
子牛胎児血清(FCS)	シグマ・アルドリッチ	12003C	細胞培養に適しています
血球計算盤	マリエンフェルド	640210
組織培養フラスコ	BDファルコン	3175167	75センチ2
ヒト血漿由来のビトロネクチン(Vn)	シグマ・アルドリッチ	V8379-50UG	細胞培養グレード