$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. ヒト血清の殺菌活性に対するVn依存性耐性の解析
- 正常なヒト血清(NHS)は、市販の供給元から購入します。ビトロネクチンまたはVn枯渇血清(VDS)を調製します。NHSに存在するVnと同等の180 nM VnをVDSに補充します。
- 補体タンパク質を不活性化するために、NHSを56°Cで30分間加熱することにより、熱不活化血清(HIS)を調製します><。
手記：アッセイの最適な血清濃度(5%)とインキュベーション時間(15分)は、インフルエンザ菌f型(Hif)について経験的に決定されました。これらのパラメータは、他の細菌性病原体によって異なる場合があります。
- 細菌(この場合はHif M10と変異体Hif M10Δlph)を中対数期(OD600 = 0.3)まで培養します。3,500 x gで10分間遠心分離することにより、細菌をペレット
化します。
- 2.5%(w / v)グルコース、2 mM塩化マグネシウム、MgCl2、0.15 mM塩化カルシウム、CaCl2、および0.1%(wt / vol)ゼラチンを含む1容量のデキストロースゼラチンVeronal緩衝液(DGVB++、pH 7.3)で細菌ペレットを再懸濁します。.
- 5%血清(NHS、HIS、VDS、またはVDS+180 nM Vn)を含むDGVB++100 μLに、細菌の1.5 x 103コロニー形成単位(CFU)を添加します。サンプルを37°Cで15分間インキュベートし、300rpmで振とうします。
- 反応混合物から10 μLのアリコートを0分(T0サンプル)および15分(Ttサンプル)で取り出し、チョコレート寒天にプレートします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
- インキュベーション後、プレートに現れるコロニーを数えます。次の式を使用して、死滅した細菌の割合を計算します:(Ttでのコロニー形成単位またはCFU)/(T0でのCFU)× 100。