ex vivo条件でのHIV病因を研究するためのヒト子宮頸部粘膜感染モデル

要約

出典:Introini, A., et al., Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、ヒト免疫不全ウイルス1型、HIV-1によるヒト子宮粘膜組織の生体外感染と、ゼラチンスポンジの上での気液界面でのそれらの維持を示しています。この方法により、ヒト組織内でのHIV-1の複製と病因のモニタリングが可能になります。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

>1. 子宮頸部粘膜の解剖と感染

>注:最適な結果を得るためには、手術後できるだけ早く、理想的には手術の同じ日に、子宮頸管粘膜の外植片を処理して感染させる必要があります。あるいは、検体をCMT(抗生物質を添加した培養培地)に4°Cで一晩浸漬し、解剖後すぐに感染させることもできます。

1. CMがRTに到達するのに十分な時間を確保するか、37°Cに予め温めたウォーターバスに入れます。使用前にCMに抗生物質溶液(CMT)を補充してください。残った抗生物質溶液は捨ててください。70%エタノール溶液を清潔な容器に注ぎ、解剖手順中に必要なときにいつでも鉗子とメスを浸します。ツールを清掃し、複数のドナーからの検体を解剖する間にメスの刃を交換します。
2. 滅菌鉗子を使用して、サンプルを輸送容器から10〜20mLのCMTが入った100mmのシャーレに移します。
3. ペトリ皿の蓋を切断面として使用して、組織を解剖します。鉗子で組織をやさしく保持し、外頸部および/または子宮頸部の粘膜をメスと刃で間質および筋肉組織(粘膜下組織)の下から分離し、粘膜のストリップを取得します
   手記： 1つの組織で作業している間は、組織の乾燥を避けるために、残りの組織を培地に浸しておくことが重要です。
4. 粘膜を2mm幅に切り、粘膜下組織をできるだけ多く取り除いて廃棄し、厚さ2mmの組織層だけを残します。ストリップを厚さ2mmのブロックにカットします。これにより、組織外植片は約8 mm³.
   になります。 注意:人間の標本を解剖するために鋭利な工具を取り扱うと、怪我や汚染のリスクが高まります。オペレーターは、追加の保護として、金属、メッシュ、および耐切創性の手袋を着用することを検討する必要があります。
5. 解剖を進めながら組織の乾燥を避けるために、10〜20 mLのCMTを含む新しい100 mmシャーレに組織外植片を移します。解剖の最後に、プレートを渦巻いて外植片の分布をランダム化します。
6. 滅菌鉗子を使用して、外植片を滅菌1.5 mL円錐管に移します(チューブあたり最大16個の外植片)。ピペットを使用してチューブ内の媒体をすべて取り出します。
7. HIV-1調製物を37°Cの水浴で解凍します。必要に応じて、ウイルスストックをCMで希釈し、ウイルスを外植片を含むチューブに移します。残留ウイルス製剤は廃棄します.
   手記：ウイルスストックは、選択した接種物が最小0.5 mLの容量に含まれるように希釈する必要があります(表1)。独立した実験間での結果のばらつきを減らすために、研究全体で同じウイルス調製物を使用する必要があります(材料表)。
8. チューブをサーモシェーカーに移し、300rpmで揺さぶりながら37°Cで2時間インキュベートします。チューブを30〜60分ごとに数回ゆっくりと反転させます.
   注:効率的な感染のためには、HIV-1製剤を解凍してからチューブを37°Cに移すまでの最小限の時間を使用することが重要です。
9. 6ウェルプレートに、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)のウェルあたり3〜4 mLを満たします。HIV-1とのインキュベーションの時点で、チューブ内のすべてのウイルス調製物をピペットを使用して消毒液の入った容器に捨てます。鉗子を使用して、外植片をPBSを含む6ウェルプレートに移します。
10. 外植片をRTでPBSで1分間休ませてから、PBSをウェルに2〜3回ピペッティングして洗浄します。PBSをピペットを使用して消毒液の入った容器に廃棄します。各ウェルに3〜4 mLの新しいPBSを加えます。さらに2回繰り返して、合計3回の洗濯を行います。組織の乾燥を避けるために、外植片をスポンジに移す直前にPBSを廃棄してください
    手記： 子宮頸管粘膜、特に子宮頸管の外植片は、感染中に大量の粘液を放出します。外植片への非特異的な保持とその後の培養上清へのウイルスの放出はウイルスの複製を隠す可能性があるため、できるだけ多くの粘液を洗浄して除去することが重要です。
11. 鉗子を使用して、12ウェルプレートの各ゼラチンスポンジの上に5〜8個の外植片を移します。プレートをインキュベーターに戻します。
12. すべての生物学的廃棄物は、危険な生物製剤の取り扱いに関する研究所の規制および特定のリスク評価に従って、反対側の容器に廃棄してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ゲルフォーム12-7mm吸収性ゼラチンスポンジ	ファイザー	NDC:0009-0315-08	GelfoamとSpongostanは、扁桃組織と子宮頸部組織の両方の組織観察で同等に優れた性能を発揮します。
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm 吸収性止血ゼラチンスポンジ	フェロサン医療機器	MS0002	GelfoamとSpongostanは、扁桃組織と子宮頸部組織の両方の組織観察で同等に優れた性能を発揮します。
RPMI 1640 フェノールレッドとグルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21875034	MEM非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシン、アムホテリシンB、FBS 15%(v / v)を添加RPMI1640、培地(CM)を作製します。
滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH 7.4 w / o カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド			手術用検体の保管・輸送に使用します。PBSは、生理学的pHを持つ別の等張溶液に置き換えることができます。培地は一晩保存するのに最適です。
滅菌細胞培養グレードの水
70%エタノール溶液
生物廃棄物処理用消毒液
滅菌金属鉗子またはピンセット
滅菌金属ハサミ
滅菌フラット計量金属ヘラ
滅菌メスとブレード
6ウェル細胞培養プレート
滅菌ペトリ皿、100 mm×20 mm
無細胞HIV-1ウイルス製剤HIV-1BaL	NIHエイズ試薬プログラム	510	ウイルスを増殖させて、いくつかの実験を行うのに十分な大きさのストックを生成する必要があります。ウイルスを懸濁し、-80°Cで保存し、凍結と解凍の繰り返しを避けてください。
無細胞HIV-1ウイルス製剤 HIV-1LAI.04	NIHエイズ試薬プログラム	2522	ウイルスを増殖させて、いくつかの実験を行うのに十分な大きさのストックを生成する必要があります。ウイルスを懸濁し、-80°Cで保存し、凍結と解凍の繰り返しを避けてください。
滅菌済み1.5および2mLスクリューキャップチューブ
37°Cに設定されたウォーターバス
生物学安全キャビネット
1.5 mLチューブ用加熱ブロック付きドライバスシェーカー、37 °C、300 rpmに設定

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