分泌胚性アルカリホスファターゼレポーターアッセイを用いた生理活性型I型インターフェロンの定量(英語)

Abstract

出典: Bego, M. G. et al., Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4⁺ T cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、HEK-Blueインターフェロンα/βレポーター細胞を使用して、HIV-1感染CD4⁺ T細胞による形質細胞様樹状細胞の刺激後に放出されるI型インターフェロン(IFN)を定量するための分泌型アルカリホスファターゼアッセイを示しています。

Protocol

1. HEK-Blue IFN-α/βレポーター細胞を用いた生理活性I型IFNの測定。

>注:これらの細胞は、HEK293細胞とヒトSTAT2およびIRF9遺伝子を安定的にトランスフェクションして、完全に活性なI型IFNシグナル伝達経路を得ることによって生成されました。また、IFN-α/β誘導性ISG54プロモーターの制御下にある分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子も含んでいます。これらの細胞をI型IFNで刺激すると、JAK/STAT/ISGF3経路が活性化され、SEAPの産生が誘導されます。

1. 10% FBSを添加したDMEMでHEK-Blue IFN-α/β細胞を維持します。平底の96ウェルプレートにウェルあたり50,000細胞の密度でプレートし、最終容量は180μlです。
2. 220 μl の PBMC (850,000 細胞/mLで希釈) または 220 μl の形質細胞様樹状細胞 (pDC) (濃度 100,000 から 500,000 cells/ml) を 1 ウェルあたり 30 μl の感染 T 細胞 (10⁶ 細胞/mL) と U-bottom 96 ウェルプレートで混合します。
3. 共培養物を37°Cおよび5%CO₂で18〜22時間インキュベートし、次いでV底96ウェルプレートに移します。400 x gで5分間遠心分離します。
4. 20 μlの共培養上清を各ウェルに二重に添加します。各プレートには、一連の内部標準コントロール(ヒトIFNα、最終濃度100 U/mlから2,500 U/ml)も必要です。プレートを37°Cおよび5%CO₂で18〜22時間インキュベー
トします。
5. QUANTI-Blue溶液を使用してアルカリホスファターゼ活性のレベルを測定します。QUANTI-Blue溶液は、酵素の存在下でピンク色から紫色/青色に変化します。QUANTI-Blueはメーカーの推奨に従って準備してください。この溶液180μlを平底96ウェルプレートの各ウェルに加えます。各ウェルに、誘導したHEK-Blue IFN-α/β細胞上清20 μlを加え、標準的なIFNコントロールウェルで色が現れるまで、プレートを37°Cのインキュベーターでインキュベー
トします。
6. 620-655 nmの分光光度計を使用してSEAPのレベルを評価し、IFN標準曲線の線形部分からの外挿によりI型IFNの濃度を決定します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MT4セル	NIHエイズ試薬プログラム	120	この試薬は、NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4を通じて、Douglas Richman博士から入手しました。
HEK-Blu IFN-α/βレポーター細胞	インビボゲン	HKB-IFNABの
RPMI(ルプミ)	ヨーロッパバイソン	350-000-CL
DMEM	ヨーロッパバイソン	319-005-CL
FBSの	ヨーロッパバイソン	〒080-150
PHA-L	シグマ・アルドリッチ	O2769
CD4+ T細胞単離キットII	ミルテニー	〒130-091-155
ダイヤモンド形質細胞様樹状細胞単離キットII	ミルテニー	〒130-097-240
クアンティブルー	シダーレーン	レップQB2
2.5 mg / mlヒトIgG	シグマ・アルドリッチ	イ4506