哺乳類系を介したインフルエンザウイルス様粒子の生成技術

要約

出典:Arevalo, M. T., et al.ワクチン接種のためのウイルス様粒子の発現と精製。 J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオは、哺乳類のシステムでインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を生成する方法を示しています。3つの真核生物の発現ベクター(異なるウイルス構造タンパク質をコードする)を適切な哺乳類宿主細胞に発現させると、発現したウイルスタンパク質は宿主の原形質膜上でVLPに自己組織化し、細胞表面から出芽して放出されます。

プロトコル

1. インフルエンザH3N2 VLPの生成のための哺乳類発現系

1. サブクローンウイルス構造糖タンパク質ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)Gag(グループ特異的抗原)p55を、前述のpTR600などの真核生物発現ベクターに注入します。
2. 化学的にコンピテントな大腸菌(DH5αなど)でDNAを増幅し、メーカーの指示に従ってプラスミド精製キットを使用してトランスフェクショングレードのプラスミドを単離します。DNAの量は、収量とユーザーのニーズに依存します。
3. 哺乳類細胞株293Tを、10%ウシ胎児血清(FBS)を含む増殖培地、5%_CO2、加湿インキュベーターで37°Cで維持します。
4. T-150組織培養フラスコがフラスコあたり45-75 x 10⁶個の細胞を含むように細胞を増殖させ、フラスコが翌日までに完全な細胞接着と85-95%の細胞密度を達成するようにします。顕微鏡で細胞を検査し、目的のコンフルエンシーを探します.
   手記：市販のトランスフェクション試薬を使用する場合、細胞毒性を最小限に抑えて最適なタンパク質発現を得るためには、通常、高い細胞密度が推奨されますが、過度にコンフルエントすると、細胞廃棄物の副産物が蓄積し、細胞生存率が低下する可能性があります。
5. トランスフェクション当日は、メーカーの推奨に従ってリポソームとDNAの混合物を調製し、DNA組成が1:1:2のHA:NA:Gagで、T-150フラスコあたり総DNA量が40μgのDNA細胞をトランスフェクションします。DNAおよびリポソーム溶液を抗生物質を含まない無血清トランスフェクション培地で希釈し、各フラスコに総容量20〜30 mlが含まれるようにします><。 手記：遺伝子コンストラクトの比率には、ユーザーの最適化が必要な場合があります。ここでは示されていませんが、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)FとHIV Gagを1:1の比率で同様のトランスフェクション手順が実施されています。DENVおよびCHIKVの単一発現プラスミドの場合、T-150フラスコあたり合計20 μgのDNAを使用して最適な発現を実現します。DNA:トランスフェクション試薬の比率はユーザーによって最適化されています。トランスフェクション法に基づく推奨トランスフェクション培地、すなわちポリカチオン性脂質トランスフェクションは、ウシ胎児血清の減少または不在を推奨するため、培地には成長ホルモンおよび微量元素を補充して、血清不在下での成長をサポートすることができます。
6. フラスコを5% CO₂インキュベーターで37°Cに戻します。200mlの容量の場合、9つのT-150フラスコを使用します。細胞は、VLPの収穫日までトランスフェクション培地に保持されます。
7. トランスフェクション後72〜96時間後、または抗原に応じて、または細胞生存率が顕微鏡検査で推定されるように70〜80%に低下したときに、細胞から培養上清を回収します。上清を50 mLの円錐管に移し、細胞を500 × gで4°Cで5分間回転させ、細胞の破片をペレット化します><。 注:3日間の上清を、あらかじめ温めた新鮮な無血清トランスフェクション培地で接着細胞に置き換えた場合、同等またはわずかに減少した収量のVLPが2ロット目になりますので、ユーザー自身で最適化する必要があります。
8. プール上清を溜め込み、0.22 μmの細孔膜でろ過してから、超遠心分離で沈殿させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プラスミドマキシキット	キアゲン	12163
DMEM	セルグロ	10-013
リポフェクタミン	ライフテクノロジー	L3000075	リポフェクタミン2000、リポフェクタミン3000
オプティMEM I	ライフテクノロジー	31985062
Cimarec I 6 マルチポイントスターラープレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	50094596
ポリクリア超遠心チューブ	シートン	7025
0.22 μm 真空フィルタートップ (500 mL)	ナルゲン	〒569-0020
グリセロール	シグマ	G5516

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