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1. バキュロウイルス/昆虫細胞系を用いたチクングニアウイルス様粒子(VLP)の発現
- 市販のバキュロウイルス発現システムを使用して、S-27株からチクングニアウイルスのカプシドおよびエンベロープタンパク質(C-E3-E2-6K-E1)を発現する組換えバキュロウイルスを生成します。
- 100 U/mlのペニシリンおよび100 μg/mlのストレプトマイシンを含む無血清Sf9成長培地でSpodoptera frugiperda Sf9細胞を28°Cで培養します。3-5 x 105 c/mlを使用して、浮遊細胞増殖のためのスピナーフラスコ培養を開始します。細胞密度が2〜4 x 106 c / ml(3〜4日ごと)に達したときに定期的に通過します。
- Sf9細胞をスピナーフラスコに懸濁液中で培養し、マルチポイントスターラープレートシステム上で130rpmで撹拌します。適切な通気のためには、培養量をスピナーフラスコの半分以下の容量に維持してください。
- チクングニアまたはCHIK VLPの発現には、2 x 106細胞/mlの密度でSf9細胞を組換えバキュロウイルスに1の感染の多重度で感染させ、28°Cのインキュベーターに戻します。通常、250mlのSf9細胞を含む1つまたは2つのスピナーフラスコに感染します
手記：この方法は使用しませんが、Sf9細胞は、シェーカープラットフォームを使用して28°Cのシェーカーフラスコで培養できます。
- 感染後72〜96時間後、または細胞生存率がメーカーのプロトコルに従ってトリパンブルーエクスクルージョンによって決定された70〜80%に低下した場合に培養物を採取します
手記：細胞は感染している間も増殖を続け、組換えCHIK VLPバキュロウイルスに感染したSf9培養物では、感染後3日(dpi)で~80%の生存率があります。バキュロウイルスに感染した細胞は、外観が大きくなります。形態も丸いものから長方形に変わることがあります。バキュロウイルス感染の後期に、細胞は溶解し始めました。
- 懸濁培養物から直接培養物を50 mLのコニカルチューブに移し、細胞を500 x gで4°Cで5分間スピンダウンします。
- 上清を採取し、0.22 μmの細孔膜でろ過してから、超遠心分離により沈殿させます。