炎症マウスモデルにおける血球-内皮相互作用を分析するための生体内顕微鏡法

要約

出典: Herr, N. et al., Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte interactions in Mesenterial Veins in Mice. J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオでは、リポ多糖を腹腔内に注入したマウスモデルの腸間膜静脈における血液細胞と内皮の相互作用をリアルタイムで可視化する方法を示します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物の取り扱い、炎症の準備、誘導

1. 16 - 20 gの重量範囲で4 - 6週齢の雄マウスを使用してください注:マウスが高齢または重い場合、血管の周囲に過剰な脂肪が現れ、顕微鏡観察が制限されます。
2. 手術前にすべてのツールと顕微鏡テーブルを滅菌してください。
3. 顕微鏡検査の4時間前に20 mg / kg LPS(リポ多糖)を腹腔内に注入し、生きているマウスに注射して、細菌の炎症を誘発します。
4. 0.9%生理食塩水を37°Cのウォーターバスで予温し、プラスチックチャンバーと腸間膜組織を加湿します。
5. 顕微鏡検査の直前に、ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(5 mg / kg)の腹腔内注射でマウスに麻酔をかけます。代替麻酔、例えば、2%イソフルラン吸入を使用することができます。反射刺激(つま先や尻尾を強くつまむ)に対する反応が失われ、適切な麻酔ができることを確認します。
6. シェーバーを使用して腹部を脱毛し、エタノール70%で飽和させたガーゼで抜け毛を取り除きます。
7. 麻酔下で、乾燥を防ぐためにマウスの目に獣医軟膏を塗ります。

2. 手術

1. 70%エタノールを使用して腹部を滅菌します。この方法は無菌法ではなく、実験の最後に致命的となる可能性があります。
2. 開腹術の中央値を実行する:小さく湾曲した鉗子と小さなハサミを使用して腹部の皮膚を開きます。上腹部血管を特定し、血管を保護するために、albaの領域で腹膜を開きます。
3. 予熱した生理食塩水を数滴腹腔に塗布して、組織を湿らせます。
4. 白血球と血小板を蛍光標識するには、50 μl のローダミン 6G (1 mg/ml) を眼窩後向きに注入します。
5. 回腸のループを外側に出し、直径10cmのシャーレに入れます。37°Cの予熱生理食塩水(0.9%)を隔分で塗布して、組織を湿らせてください。

3. 生体内顕微鏡検査

1. マウスを顕微鏡の下に置き、直径200〜300μmの腸間膜静脈を視界の中心に持ってきます。周囲に脂肪が見えない容器を選択してください。
2. 腸間膜血管に触れないようにして、内皮の刺激を避けてください。回腸ループは慎重に取り扱ってください。
3. 倒立顕微鏡または直立顕微鏡と顕微鏡ソフトウェアを使用したカメラで、血液細胞と内皮の相互作用を視覚化します。マウス1匹につき4つの異なる静脈で1分間、血液細胞と内皮の相互作用を記録します。
4. イメージング実験の完了後に、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。

>4. 分析

1. 分析をオフラインで実行し、すべてのパラメータをブラインドで実行します。適切なソフトウェアプログラムを使用して分析を実行します。
2. 管腔内血球流に焦点を当てた高時間分解能シネクリップ(最大フレームレート)で、安定した個体間比較可能な血流状態を確認します。
3. ローリング白血球の数を定量化します。したがって、静脈を通る垂直線を引き、この線を横切るすべての白血球を1分で数えます。
4. 1つの白血球が内皮上を安定して転がりながら50μmの距離を通過する時間を測定することにより、転がり速度を決定します。これを行うには、静脈を通る50μmの距離に2本の垂直線を引きます。
   1. 代表的な白血球が1つのラインから別のラインに到達するのに必要な時間を測定します。白血球の速度は、50μmを必要な時間(μm/s)で割って計算します。
5. 0.04 mm²のフィールドで白血球の接着力を測定します。これを行うには、一辺の長さが200μmの正方形を静脈に描きます。
   1. この正方形内で、30秒間目に見える動きがないと定義される固い付着性白血球を数えます。
6. 1つの白血球に結合した血小板の数をカウントして、血小板-白血球相互作用を定量化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ローダミン6G	シグマ・アルドリッチ	989*38*8
大腸菌由来のリポ多糖類055:B5	シグマ・アルドリッチ	L2637