マウスモデルにおける全身性炎症を誘発するための細菌抗原の皮下注射

要約

出典:John, S. et al., 感染後ブドウ膜炎のモデルとしてのマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)。J. Vis. Exp. (2021年度)

このビデオは、麻酔をかけたマウスの全身性炎症の誘発を示しています。マイコバクテリア抗原アジュバントデポの注射は、サイトカイン放出と限局性炎症を引き起こします。リンパ管が開くと、免疫細胞がリンパ節に侵入し、炎症誘発性サイトカインを放出するT細胞が活性化され、広範囲にわたる炎症を引き起こします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 皮下注射用抗原製剤

1. このセクションのすべての手順を化学ヒュームフード内で実行して、結核菌、Mtb H37Ra粉末の吸入または皮膚接触を防ぎます。コンプリートフロイントのアジュバント(通常はBSL-1)の機関のポリシーに従って取り扱ってください。これには、耐薬品性手袋、安全メガネ、防護作業服(白衣)の使用が含まれます。
2. 実験動物に導入される試薬の汚染を防ぐために、優れた滅菌技術を使用してください。
5
3. mLの微量遠心チューブで、凍結乾燥して加熱死滅させた結核菌H37Ra粉末5 mgと2.5 mLの冷PBSを混合して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にMtb懸濁液を充填します。30秒間一度渦を巻いてから、氷の上に置きます。
4. PBS中のH37Raの微細懸濁液を生成するには、懸濁液を氷上で5分間超音波処理します。
   1. コンバーターユニットの本体のクランプを外し、70%(v / v)アルコール綿棒でプローブを清掃します。
   2. ソニケーターのスイッチを入れ、電源制御ノブを回して電力設定を4に調整し、プローブの先端をPBS含有マイコバクテリア粉末に浸します。プローブの先端がサンプルの少なくとも半分の深さまで浸されていること、およびプローブの先端が微量遠心チューブの壁に触れていないことを確認してください。
5. 混合物を氷上で30秒間超音波処理し、30秒間一時停止し、合計5分間繰り返して、液体を加熱せずに粉末を均一な懸濁液に完全に分散させます。
6. 混合物にフロイントの不完全アジュバント2.5mLを加え、エマルジョンが歯磨き粉のような粘稠度を形成するまで氷上で超音波処理プロセスを繰り返します。
7. コントロールノブを使用して電源を0に設定し、ユニットの電源を切って超音波処理を終了します。懸濁液から先端を取り外し、アルコール綿棒でプローブを拭きます。
8. 抗原エマルジョンを4°Cで保存し、エマルジョンのバッチを作成すると、実験間での一貫性を確保するのに役立ちます。エマルジョンは、4°Cで最大3ヶ月間保存できます。

2. 皮下注射

1. 硝子体内注射の 1 週間前 (-7 日目として指定) に皮下注射を行います。
2. 1 mLのシリンジ(針が付いていない)にマイコバクテリアエマルジョンを入れます。.エマルジョンの粘度と不透明度により、見えにくい気泡がシリンジに充填される可能性があります。
   1. シリンジ内の気泡を防ぐため、0.2〜0.3mLのエマルジョンを装填した後、シリンジを反転させ(先端を上にして)、カウンターの端でシリンジを軽く叩くことで気泡を表面に浮かべます。
3. シリンジから空気を排出し、シリンジの充填を続けます。反転させ、いっぱいになるまで断続的にタップします。
4. シリンジに25Gの針を置き、エマルジョンを進めて針を満たします。シリンジは使用するまで氷の上に置いてください。
5. 皮下注射を安全に行うには、マウスに麻酔をかけるか、動物の後肢に簡単にアクセスできる人道的な拘束方法を利用します。
6. 皮下注射のために麻酔をかけるには、動物をイソフルラン誘導チャンバー(導入の場合は3%〜4%、メンテナンスの場合は1%〜3%)に入れます。麻酔をかけたら、マウスの呼吸数が遅く、呼吸困難の兆候を示さないことを確認します。
7. 皮下注射は、腰の背側表面または鼠径リンパ節の領域に近位の脚の腹側表面に置きます。.
   1. 筋肉への注入を防ぐために、針を慎重に挿入します。0.05 mLのMtbエマルジョンを皮下腔に注入します。.濃厚なエマルジョンを完全に注入するために、すぐに針を抜かないでください。.
   2. 動物ごとに合計0.1mLの注射を左右両側で繰り返します。
8. 麻酔されている場合は、完全に回復するまでマウスを温かい加熱パッドの上に置きます。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。
9. 完全に回復したらマウスをケージに戻し、皮下注射の日付をケージカードにラベル付けします。
10. 経口アセトアミノフェン (200 mg/kg/日) で鎮痛剤を提供しますが、非ステロイド性抗炎症薬 (NSAID) は投与しません。抗炎症剤はブドウ膜炎の誘発に影響を与える可能性があるためです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フロイントの不完全アジュバント	BD Difco, ニュージャージー州, USA	263910
H37Ra凍結乾燥マイコバクテリア抽出物	BD Difco, ニュージャージー州, USA	231141
インスリン針	Exel International(米国)	26029	1 mL
イソフルラン
PBSの	ギブコ	14190
RM2255	Leica Biosystems, IL,USA (米国イリノイ州)		組織切片
TBシリンジ	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー、ニュージャージー州、米国	309602	1 mL
タイレノール	Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA (米国ペンシルベニア州)	NDCの50580-614-01	アセトアミノフェン

の の