感染後ブドウ膜炎を研究するためのプライムマイコバクテリアブドウ膜炎のマウスモデル

要約

出典:John, S., et al.感染後ブドウ膜炎のモデルとしてのマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)。 J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオでは、感染後のブドウ膜炎を研究するためのプライムされたマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)のマウスモデルを生成する方法を示します。以前に同じ免疫原で免疫されたマウスに熱死結核菌の硝子体内注射によるPMUの誘導に際し、眼の慢性炎症の進行を画像診断および病理組織学的検査を用いて解析する

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 皮下注射用抗原製剤

1. このセクションのすべての手順を化学ヒュームフード内で実行して、結核菌(Mtb)H37Ra粉末の吸入または皮膚接触を防ぎます。.コンプリートフロイントのアジュバント(通常はBSL-1)の機関のポリシーに従って取り扱ってください。これには、耐薬品性手袋、安全メガネ、防護作業服(白衣)の使用が含まれます。
2. 実験動物に導入される試薬の汚染を防ぐために、優れた滅菌技術を使用してください。
3. 5 mLの微量遠心チューブで、凍結乾燥して加熱死滅した5 mgのMtb H37Ra粉末と2.5 mLの冷PBSを混合して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にMtb懸濁液を充填します。30秒間一度渦を巻いてから、氷の上に置きます。
4. PBS中のH37Raの微細懸濁液を生成するには、懸濁液を氷上で5分間超音波処理します。
   1. コンバーターユニットの本体のクランプを外し、70%(v / v)アルコール綿棒でプローブを清掃します。
   2. ソニケーターのスイッチを入れ、電源制御ノブを回して電力設定を4に調整し、プローブの先端をPBS含有マイコバクテリア粉末に浸します。プローブの先端がサンプルの少なくとも半分の深さまで浸されていること、およびプローブの先端が微量遠心チューブの壁に触れていないことを確認してください。
5. 混合物を氷上で30秒間超音波処理し、30秒間一時停止し、合計5分間繰り返して、液体を加熱せずに粉末を均一な懸濁液に完全に分散させます。
6. 混合物にフロイントの不完全アジュバント2.5mLを加え、エマルジョンが歯磨き粉のような粘稠度を形成するまで氷上で超音波処理プロセスを繰り返します。
7. コントロールノブを使用して電源を0に設定し、ユニットの電源を切って超音波処理を終了します。懸濁液から先端を取り外し、アルコール綿棒でプローブを拭きます。
8. 抗原エマルジョンを4°Cで保存し、エマルジョンのバッチを作成すると、実験間での一貫性を確保するのに役立ちます。エマルジョンは、4°Cで最大3ヶ月間保存できます。

2. 皮下注射

1. 硝子体内(IVT)注射の1週間前(-7日目として指定)に皮下注射を行います。
2. 1 mLのシリンジ(針が付いていない)にマイコバクテリアエマルジョンを入れます。.エマルジョンの粘度と不透明度により、見えにくい気泡がシリンジに充填される可能性があります。
   1. シリンジ内の気泡を防ぐため、0.2〜0.3mLのエマルジョンを装填した後、シリンジを反転させ(先端を上にして)、カウンターの端でシリンジを軽く叩くことで気泡を表面に浮かべます。
3. シリンジから空気を排出し、シリンジの充填を続けます。反転させ、いっぱいになるまで断続的にタップします。
4. シリンジに25Gの針を置き、エマルジョンを進めて針を満たします。シリンジは使用するまで氷の上に置いてください。
5. 皮下注射を安全に行うには、マウスに麻酔をかけるか、動物の後肢に簡単にアクセスできる人道的な拘束方法を利用します。
6. 皮下注射のために麻酔をかけるには、動物をイソフルラン誘導チャンバー(導入の場合は3%〜4%、メンテナンスの場合は1%〜3%)に入れます。麻酔をかけたら、マウスの呼吸数が遅く、呼吸困難の兆候を示さないことを確認します。
7. 皮下注射は、腰の背側表面または鼠径リンパ節の領域に近位の脚の腹側表面に置きます。.
   1. 筋肉への注入を防ぐために、針を慎重に挿入します。0.05 mLのMtbエマルジョンを皮下腔に注入します。.濃厚なエマルジョンを完全に注入するために、すぐに針を抜かないでください。.
   2. 動物ごとに合計0.1mLの注射を左右両側で繰り返します。
8. 麻酔されている場合は、完全に回復するまでマウスを温かい加熱パッドの上に置きます。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。
9. 完全に回復したらマウスをケージに戻し、皮下注射の日付をケージカードにラベル付けします。
10. 経口アセトアミノフェン (200 mg/kg/日) で鎮痛剤を提供しますが、非ステロイド性抗炎症薬 (NSAID) は投与しないでください。抗炎症剤はブドウ膜炎の誘発に影響を与える可能性があるためです。

3. 硝子体内注射用抗原ストック製剤

1. このセクションのすべての手順を適切な滅菌条件下で実行し、硝子体内Mtb懸 ?? 液の汚染を防ぎます。.
2. 硝子体内懸濁液を作成します。
   1. 軽度から中等度の汎ブドウ膜炎の誘発には、5 mgのマイコバクテリア抽出物を1 mLの1x PBSに加えて、硝子体内懸 ?? 液を5 mg / mLの濃度で調製します。.
   2. 中等度から重度の汎ブドウ膜炎の誘発には、10 mgのマイコバクテリア抽出物を1 mLの1x PBSに加えて、硝子体内懸 ?? 液を10 mg / mLの濃度で調製します。.
3. 30秒間一度渦を巻いてから、氷の上に置きます。
4. PBS中のH37Raの微細懸濁液を生成するには、ステップ1.4で説明したように、懸濁液を氷上で10分間超音波処理します。このストック溶液を100 μLの容量で分注し、-20°Cで保存します。
5. 使用前に、室温で解凍し、強火で1分間解凍します。アリコートを氷の上に置いて、動物施設に輸送してください。

>4. 0日目の硝子体内注射手順

1. 動物の調理法
   1. フィットした検査用手袋を着用し、マウスを計量天びんに置いて、グラム単位で重量を取得します。
   2. 100 mg/mL のケタミンと 20 mg/mL のキシラジンを滅菌水と混合した溶液に 0.02 mL/g 体重の腹腔内注射を行い、動物に麻酔をかけます。別のアプローチには、~1.5% イソフルラン (吸入) を使用した誘導が含まれます。
   3. マウスが眠りにつくまで約2分待ってから、マウスを保温ボックスに入れ、蓋を覆います。耳、つま先、尻尾をつまむなどの疼痛反射テストを実施して、手順の麻酔の深さを評価します。
   4. 眠ったら、0.5%(v / v)テトラカインを1滴垂らして角膜に麻酔をかけます。.マウスの鼻や口の近くにテトラカインを入れないでください。10秒後、余分な液体を軽くたたきます
      手記： 局所麻酔を投与すると、虹彩拡張と前房 (AC) の視覚化が改善されることが観察されていますが、これはおそらく全身麻酔と局所麻酔の組み合わせによる角膜反射抑制の改善によるものです。ただし、必要に応じてこの手順を省略することもできます。
   5. 2.5%(v / v)フェニレフリンを1滴垂らして瞳孔を拡張します。鼻や口に入る可能性のある余分な飛沫を避けるために注意してください。2〜3分後、余分な液体を軽くたたきます。
   6. 眼内炎のリスクを減らすには、目の表面と周囲の髪に5%ベタジンを1滴加えます。.2〜3分間目に置いておきます.
      手記：眼内炎を予防するために、このセクションのすべての手順を適切な滅菌条件下で実行してください。
   7. ベタジンを取り除き、ヒプロメロース(0.3%)またはカルボマーアイジェル0.2%w / w)で目を覆い、麻酔下での乾燥を防ぎます。.これは、白内障の形成を防ぐのにも役立ちます。
2. マイクロインジェクションシステムのセットアップ
   1. マイクロシリンジポンプコントローラーと注入シリンジに接続されたマイクロポンプを使用して、硝子体内注入を行います(図1A-C)。あるいは、サブセクション4.4で説明されているように、ハミルトンシリンジに取り付けられた33Gの針で注入します。.
   2. 34Gの針をインジェクションホルダーに接続して、インジェクターを組み立てます。インジェクションホルダー前端の銀色のスクリューキャップを緩め、針をホルダー本体のほぼ半分までスライドさせます。銀色のネジキャップを指でしっかりと締めます。
   3. 手順4.2.4-4.2.5で説明したように、チューブをインジェクションホルダーに接続します。
   4. インジェクションホルダーにチューブを挿入するには、ホルダーの後端にあるプラスチックネジを緩め、チューブを内側のガスケットにスライドさせて、ネジを締めます。
   5. 注入中のチューブの損傷を防ぐために、チューブの端とわずかな隙間を保ってください。図 1C を参照してください。
   6. マイコバクテリウムストック懸濁液の100μLアリコートを解凍します。
   7. 1%フルオレセインナトリウム(AK-Fluor)溶液3μLを加え、ボルテックスウェルでボルテックスします。
   8. 10 μLシリンジに抗原とフルオレセインの混合物を含まずにロードします。
   9. ローディングニードルをシリンジから取り外し、先端がシリンジ本体のゼロマークに達するまで、チューブを銀色のスクリューキャップガスケットに通します。
   10. チューブの先端が目的の位置に正しく位置合わせされたら、スクリューキャップの指をしっかりと締めます。
   11. シリンジ内の溶液を注射チューブを通して洗い流し、システムに完全に負荷をかけます。次に、手順4.2.8〜4.2.11を繰り返して、注射用のシリンジを再ロードします。
   12. ロードされたシリンジをマイクロポンプに取り付けるには、clを押しますamp マイクロポンプの端にあるリリースボタンを押して、シリンジを開きますamps 。
   13. プランジャーのキャップをマイクロポンプの後端にあるプランジャーキャップホルダーに配置します。
   14. 次に、シリンジカラーをカラーストップにスライドさせ、シリンジ本体をシリンジクランプにスライドさせます。
   15. clを放すamp ボタンをクリックし、プランジャー固定ネジを締めます。図 1D を参照してください。
   16. 注入ホルダーと針を定位注射装置のOクランプに通します。これはカスタムプラットフォームです。あるいは、シリンジを手動で保持して配置することもできます。
   17. マイクロシリンジポンプコントローラーの注入量と注入量の速度を、それぞれ500 nL / sの速度でサイクルあたり40 nLを注入するように設定します
       手記：より速い注入速度を使用できますが、針の再配置が達成される前に、より多くの逆流が発生する可能性があります。
   18. 硝子体内注射を行う前に、システムを正しく機能させるためにテストしてください。
       手記：インジェクションシステムが正常に機能している場合、フットペダルまたはコントロールパッドを使用してインジェクションサイクルを作動させると、プランジャーキャップホルダーが目に見える動きをし、針の先端に緑がかった液体の小さな液滴が見られます。液体が生成されない場合は、追加のサイクルをアクティブにするか、シリンジをフラッシュして再ロードします。
   19. 眼を注入する前に、95%エタノールパッドで針をやさしく拭いてください。.
3. 硝子体内注射手順
   1. マウスを脳定位固定装置に載せて、注射手順を行います。
   2. マウスが置かれているステージ/プラットフォームを暖かく保つには、マウスの表面に2〜3枚のペーパータオルを取り付けます。
   3. マウスをプラットフォーム上で腹臥位に置きます。左右のイヤーバーを使用して、動物の頭をやさしく固定します。図 1E を参照してください。
   4. マウスを配置し、右目の上鼻の側面が見えるようにスコープの下に向けます。
   5. 30Gの針を使ってまつげをずらし、強膜を露出させます。輪部と橈骨血管を視覚化します。
   6. 滅菌済みの30G針を使用して、強膜のリンバス後方1〜2mmにガイド穴を開けます。
   7. 注入ホルダーに取り付けられた34Gの針を、レンズを避ける角度でガイド穴から眼に挿入しますが、針先を硝子体腔に入れます。
   8. マイクロシリンジポンプコントローラーを使用して、1 μLのMtb抽出物を硝子体腔に慎重に注入します。逆流が続く場合は、注入量を1.5μLに増やして、適切な用量の送達を確保します。
      手記：偽のコントロールの場合は、1 μLのPBSを動物の眼に注入します。
   9. 目の中の緑がかった反射を視覚化することにより、硝子体内の配置を確認します。図 1F を参照してください。
   10. 10秒後、針を目から引き抜きます。逆流に注意してください。
   11. マウスをプラットフォームから取り外し、角膜保護のために両目に0.3%ヒプロメロースまたは0.2%w / wカルボマー眼軟膏を置き、回復保温ボックスに移動します。.
   12. マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物と一緒に戻らないでください。
   13. マウスが完全に目覚めたら、ケージに戻り、アセトアミノフェン(200-300 mg / kg /日)の薬用水ボトルを追加します。ケージカードにIVT注射の日付をラベル付けします。
   14. 硝子体内注射は一般的に忍容性が良好です。.痛みや研究からの除外の必要性を示す可能性のある臨床徴候には、眼周囲脱毛症 (自己外傷の指標)、角膜潰瘍、体重減少、猫背姿勢などがあります。

結果

図1:マウス硝子体内注入のセットアップ。硝子体内注射は、(A)マイクロポンプに接続されたマイクロシリンジポンプコントローラーと(C)注射器を使用してマウスの眼に対して行われます。シリンジは(D)マイクロポンプに装填され、取り付けられます。マウスヘッドは、硝子体内注射手順中の安定性と一貫性を確保するために、(E)イヤーバーを使用して配置されます。(F)注射液中のフルオレセインは、手術が成功した後、眼内から緑がかった反射を生成します。.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AKフロー	Akorn Pharmaceuticals, IL, 米国		10% フルオレセインナトリウム 100 mg/mL (5 mL バイアル中
アナセド	Akorn Animal Health, IL, 米国	NDCの59399-110-20	キシラジン20 mg / mL
ベタジン5%滅菌点眼用調製液	アルコン、テキサス州、米国	8007年1月
BDプレシジョングライドニードル-25 g	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー、ニュージャージー州、米国	305122
B-D プレシジョングライドニードル -30-G	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー、ニュージャージー州、米国	305106
ボンドMAX、ボンドRx	Leica Biosystems, IL,USA (米国イリノイ州)		自動IHC染色システム
クロラムフェニコール軟膏	Martindale Pharma、ロムフォード、英国		1% w / wクロラムフェニコール
EG1150H	Leica Biosystems, IL,USA (米国イリノイ州)		ティッシュ
エンビスR2300	Bioptigen/ライカ		OCTマシン
フロイントの不完全アジュバント	BD Difco, ニュージャージー州, USA	263910
ジェンティール潤滑剤眼軟膏	アルコン、テキサス州、米国	---
ジェンティール ルーブリッシング アイジェル	アルコン、テキサス州、米国	---
H37Ra凍結乾燥マイコバクテリア抽出物	BD Difco, ニュージャージー州, USA	231141
ハミルトン RN ニードル (33/12/2)S	ハミルトン、リノ、ネバダ州	7803-05(2/12/33)	33グラム
ハミルトンシリンジ	ハミルトン、リノ、ネバダ州	CAL7633-01	5 μL
インスリン針	Exel International(米国)	26029	1 mL
イソフルラン
ケタセット	Zoetis, アメリカ	377341	ケタミンHCL 100 mg/mL
マイクロインジェクションシリンジポンプとMicro4Controller	World Precision Instruments, FL, USA (米国フロリダ州	UMP3
マイクロンIV	フェニックス研究所、カリフォルニア州プレザントン		代替イメージング/ OCTマシン
Nanofil 10 μL シリンジ	World Precision Instruments, FL, USA (米国フロリダ州	ナノフィル
Nanofil眼内注射キット	World Precision Instruments, FL, USA (米国フロリダ州	IOキット
オリンパスSZX10	オリンポス		解剖範囲
PBSの	ギブコ	14190
フェニレフリン塩酸塩点眼液USP 2.5%滅菌15mL	Akorn Pharmaceuticals, IL, 米国	17478020115
RM2255	Leica Biosystems, IL,USA (米国イリノイ州)		組織切片
TBシリンジ	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー、ニュージャージー州、米国	309602	1 mL
テトラカイン 0.5%	アルコン、テキサス州、米国	1041544
ティッシュテックVIPシリーズ	Sakura Finetek USA, Inc.,カリフォルニア州		組織学組織プロセッシング
トロピカミド 1%	Chauvin Pharmaceuticals、ロムフォード、英国		ミニムス
タイレノール	Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA (米国ペンシルベニア州)	NDCの50580-614-01	アセトアミノフェン
ビスコティアーズ	ノバルティス・ファーマシューティカルズ、キャンベリー、英国		カルボマーアイジェル0.2%w / w