感染に対するマイコバクテリウム・ボビスBCGルクス接種の調製と定量

要約

出典:Asai, M. et al., Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、生物発光アッセイとコロニー形成単位の列挙を使用して、Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux inoculumの調製と定量を示しています。調製した接種物は、感染研究に使用できます。

プロトコル

>注:以下に説明するすべての作業は、地域の健康と安全のガイドラインに従って、クラス2微生物学的安全キャビネット(MSC)内のCL2実験室で実施されます。

>1. M. bovis BCG luxの感染に対する調製

1. モントリオールのワクチン株であるM. bovis BCG luxの凍結1.2 mLグリセロール(15%)ストックを、ルシフェラーゼ酵素をコードするVibrio harveyiのluxAB遺伝子を運ぶシャトルプラスミドpSMT1で形質転換します。
2. 0.2%グリセロール、10%アルブミン、デキストロース、カタラーゼ(ADC)濃縮、および50μg / mLのハイグロマイシンを含む15 mLのMiddlebrook 7H9ブロスに、1.2 mLのBCG luxアリコートを解凍して、標識された250 mLの三角フラスコに接種します。.
3. フラスコを密閉されたバイオセーフティ容器に入れ、オービタルシェーカーインキュベーターで37°C、220rpmで72時間(または培養物が成長の中間ログ段階に達するまで)インキュベー
トします。
4. リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4、0.01 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウム、および0.137 M塩化ナトリウム)を二重に使用して、ルミノメーターチューブで培養物の1:10希釈液を調製することにより、BCG lux培養物の増殖を確認します。渦巻き、ルミノメーターチューブをルミノメーターにロードし、n-デシルアルデヒドを基質として使用して生物発光(相対光単位[RLU]/ mL)を測定します(無水エタノールで1% v / v)
   手記：RLU/コロニー形成単位(CFU)の比率は、BCG luxをMiddlebrook 7H9ブロスでin vitroで成長させたとき、以前は3:1であると決定されていました。
5. 培養物を2,175 x gで室温で10分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を既知のマイコバクテリア活性を持つ適切な消毒剤に廃棄します。すべての培養廃棄物は、地域のガイドラインに従って、マイコバクテリアに適した消毒剤で処分してください。
6. 0.05%ポリソルベート80(PBS-T)を含むPBSで細胞ペレットを2回洗浄し、細菌の凝集を防ぎます。
7. 最終洗浄後、廃棄物上清をデカントし、マイコバクテリア細胞ペレットをPBS-Tに再懸濁し、RLU測定を使用してマイコバクテリア懸濁液を目的の細胞密度に希釈します。
8. PBS-Tを使用して、24ウェルプレートで接種の10倍段階希釈液を調製します。10 μL を Middlebrook 7H11 寒天プレート (0.5% グリセロール、50 μg/mL ハイグロマイシン、10% オレイン酸、アルブミン、デキストロース、カタラーゼ [OADC]) に二重にプレートアウトして、接種 CFU カウントを列挙します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5ml反応チューブ(エッペンドルフ)	エッペンドルフ	22431021
20、200、1000 μlのピペットとフィルター付きチップ	任意のサプライヤー	該当なし
24ウェル培養プレート	グライナー	662160
25mlピペットとピペットボーイ	任意のサプライヤー	該当なし
3コンパートメントシャーレ(94 / 15mm)	グライナー	637102
遠心機	任意のサプライヤー	該当なし
クラス II 安全キャビネット	任意のサプライヤー	該当なし
エタノール (>99.7%)	VWRの	208221.321
グリセロール	シグマ・アルドリッチ	G5150
ハイグロマイシンB	コーニング	30-240CR
ルミノメーター(Autolumat LB 953)	ベルトルト	34622さん
ルミノメーターチューブ	コーニング	352054
マイクロ遠心分離機	任意のサプライヤー	該当なし
ミドルブルック7H11寒天	BDバイオサイエンス	283810
ミドルブルック7H9スープ	BDバイオサイエンス	271310
ミドルブルックADCエンリッチメント	BDバイオサイエンス	212352
ミドルブルックOADCエンリッチメント	BDバイオサイエンス	212240
マイコバクテリウム・ボビス BCG lux	諸	該当なし
n-デシルアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	D7384-100G
オービタル振盪インキュベーター	任意のサプライヤー	該当なし
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ・アルドリッチ	P4417-100TAB
ポリソルベート80(Tween-80)	シグマ・アルドリッチ	P8074-500ミリリットル
ベントキャップ付き三角フラスコ(250 ml)	コーニング	CLS40183
Winterm(V1.08)	ベルトルト	該当なし	プログラムLB953.TTB