昆虫幼虫におけるルシフェラーゼ発現細菌の生体内負荷の測定

要約

出典:Asai, M. et al., 結核菌複合体を研究するための感染モデルとしての無脊椎動物のガレリア・メロネラの使用。 J. Vis. Exp. (2019年度)

このビデオでは、Bacillus Calmette-Guérin、BCG、lux感染昆虫の幼虫を使用したin vivo細菌負荷測定を紹介しています。このプロセスには、幼虫の均質化、ルシフェラーゼ基質による処理、および細菌負荷と相関する相対的な光単位を決定するための生物発光測定が含まれます。

プロトコル

>注:以下に説明するすべての作業は、地域の健康と安全のガイドラインに従って、クラス2微生物学的安全キャビネット(MSC)内のCL2実験室で実施されます。

>1. M. bovis BCG luxの感染に対する調製

1. モントリオールのワクチン株であるMycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin(BCG)luxの冷凍1.2 mLグリセロール(15%)ストックを解凍し、ルシフェラーゼ酵素をコードするVibrio harveyi由来のluxAB遺伝子を運ぶシャトルプラスミドpSMT1で形質転換します。
2. 0.2%グリセロール、10%アルブミン、デキストロース、カタラーゼ(ADC)濃縮、および50μg / mLのハイグロマイシンを含む15 mLのMiddlebrook 7H9ブロスに、1.2 mLのBCG luxアリコートを解凍して、標識された250 mLの三角フラスコに接種します。.
3. フラスコを密閉されたバイオセーフティ容器に入れ、オービタルシェーカーインキュベーターで37°C、220rpmで72時間(または培養物が成長の中間ログ段階に達するまで)インキュベー
トします。
4. リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4、0.01 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウム、および0.137 M塩化ナトリウム)を二重に使用して、ルミノメーターチューブで培養物の1:10希釈液を調製することにより、BCG lux培養物の増殖を確認します。渦巻き、ルミノメーターチューブをルミノメーターにロードし、n-デシルアルデヒドを基質として使用して生物発光(相対光単位[RLU]/ mL)を測定します(無水エタノール中で1% v / v)。
   注:RLU /コロニー形成単位(CFU)の比率は、BCGルクスをMiddlebrook 7H9ブロスでin vitroで成長させたときに、以前に3:1と決定されていました。
5. 培養物を2,175 x gで室温で10分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を既知のマイコバクテリア活性を持つ適切な消毒剤に廃棄します。すべての培養廃棄物は、地域のガイドラインに従って、マイコバクテリアに適した消毒剤で処分してください。
6. 0.05%ポリソルベート80(PBS-T)を含むPBSで細胞ペレットを2回洗浄し、細菌の凝集を防ぎます。
7. 最終洗浄後、廃棄物上清をデカントし、マイコバクテリア細胞ペレットをPBS-Tに再懸濁し、RLU測定を使用してマイコバクテリア懸濁液を目的の細胞密度に希釈します。
8. PBS-Tを使用して、24ウェルプレートで接種の10倍段階希釈液を調製します。10 μL を Middlebrook 7H11 寒天プレート (0.5% グリセロール、50 μg/mL ハイグロマイシン、10% オレイン酸、アルブミン、デキストロース、カタラーゼ [OADC]) に二重にプレートアウトして、接種 CFU カウントを列挙します。

2. G. mellonella幼虫の調製

1. 適切な供給源から最後の幼虫を購入し、到着時に幼虫を18°Cの暗闇で維持し、購入後1週間以内に使用してください。あるいは、幼虫はJojāoらのプロトコルに従って自家飼育することができます。購入した幼虫については、死んだ幼虫、変色した幼虫、または蛹化した幼虫は、保管する前に廃棄してください。
   注:蛹化幼虫は、形態学的に最後の幼虫と区別できます。
2. 変色(メラニン化)がほとんどまたはまったくない均一なクリーム色、サイズ(長さ2〜3 cm)、体重(約250 mg)、高レベルの運動性を示し、ひっくり返ったときに自分自身を立て直す能力を持っていることに基づいて、実験用の健康な幼虫を特定し、選択します。
3. 健康な幼虫(グループあたり最低20〜30匹)を慎重に数え、濾紙(94/15 mm)の層で裏打ちされたシャーレ(94/15 mm)に鈍い端のピンセットを使用して汚染を最小限に抑え、使用まで室温で暗所で保管します。

>3. G. mellonella の BCG lux への感染

1. MSC内の乱雑さを最小限に抑えて、汚染や針刺しによる損傷のリスクを減らします。
2. 円形の濾紙(94 mm)を平らな隆起面にテープで留めて、注入プラットフォームを準備します。柔らかい表面または硬い表面を使用でき、ピペットボックスの蓋やナイロン製の精練スポンジなど、ユーザーの好みに完全に依存します。
3. 25 μL マイクロシリンジ (25 G) を 3 容量の 70% エタノールを吸引して滅菌し、さらに 3 容量の滅菌 PBS-T ですすぎます。
4. 10 μL の BCG ルクス接種物 (セクション 1 で調製) または PBS-T を滅菌した 25 μL マイクロシリンジに吸引します。PBS-Tネガティブコントロールには別のシリンジを使用してください.
   注:10回の注射後にBCGルクス接種物を再懸濁して、均一な細胞懸 ?? 液を確保します。.
5. ピンセットを使用して1匹の幼虫を拾い上げ、注射プラットフォームに置きます。
6. プラットフォーム上で、幼虫を背中にひっくり返し、ピンセットで頭と尾を固定して固定します。幼虫の頭からカウントダウンする最後の左プロレッグの位置を特定し、針の先端(5-6 mm)を水平面に対して10-20°の角度で慎重に挿入します。
   手記： 短くて細いピンセットは、幼虫のストレスを最小限に抑えて簡単に固定できます。腸に穴を開け、非BCGルクス特異的なメラニン化または死を引き起こす可能性のある過度の浸透に注意してください。
7. 感染した幼虫を濾紙の層で裏打ちされたペトリ皿に数えると、1つの90mmのペトリ皿で最大30匹の幼虫を収容できます。
8. 幼虫の入ったシャーレを、5%_CO2のインキュベーター内の37°Cの通気孔または密閉されていない暗い箱に保管します。

>4. G. mellonellaの感染後の生存状況のモニタリング

1. 時間の経過とともに、24時間ごとに幼虫の生存を監視します。幼虫は、触れると動かなくなると死んだと見なされます。

>5. G. mellonellaのBCG luxのIn vivo負荷の測定

1. 各時点で、セクション3で事前に準備した5匹の感染した幼虫をランダムに選択し、70%エタノールに浸した綿棒を使用して幼虫の表面を穏やかに滅菌します。
   注:この手順は、滅菌されていない幼虫が汚染につながる可能性があるため、マイコバクテリアCFU列挙のために幼虫ホモジネートをめっきする場合に重要です。
2. 幼虫を800 μLの滅菌PBSを含む2 mLの溶解マトリックスチューブに個別に入れます。
3. ホモジナイザーを使用して、6.0 m/sで60秒間幼虫を均質化します。
4. 溶解チューブを3,500 x gで5秒間遠心分離して蓋からホモジネートを除去し、ホモジネートを滅菌ルミノメーターチューブに個別に慎重にデカントします
   手記： CFU計数(ステップ5.7)では、滅菌済みの1.5 mL反応チューブに100 μLのホモジネートを必ず保存してください。
5. ライジングマトリックスチューブを1 mLのPBS-Tで洗浄し、対応するルミノメーターチューブにピペットで入れて、残っているホモジネートを回収します。
6. ルミノメーターチューブをボルテックスし、ステップ1.4で前述したホモジネートの生物発光を測定します。
7. PBS-Tを使用して、24ウェル培養プレートでホモジネートの10倍段階希釈液を調製します。希釈液の 10 μL を 0.5% グリセロール、50 μg/mL ハイグロマイシン、10% OADC、および 20 μg/mL ピペラシリンを含む Middlebrook 7H11 寒天プレートにプレートアウトして、in vivo 感染後の BCG lux の RLU/CFU 比を決定します。
   注:ピペラシリンは、BCGルクスの成長阻害を最小限に抑えて、天然のG.メロネラ微生物叢を排除します。.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5ml反応チューブ(エッペンドルフ)	エッペンドルフ	22431021
20、200、1000 μlのピペットとフィルター付きチップ	任意のサプライヤー	該当なし
24ウェル培養プレート	グライナー	662160
25mlピペットとピペットボーイ	任意のサプライヤー	該当なし
3コンパートメントシャーレ(94 / 15mm)	グライナー	637102
遠心機	任意のサプライヤー	該当なし
クラス II安全キャビネット	任意のサプライヤー	該当なし
ベントキャップ付き三角フラスコ(250 ml)	コーニング	CLS40183
エタノール (>99.7%)	VWRの	208221.321
ガレリア・メロネラ(250個入り)	ライブフードダイレクトUK	W250
グリセロール	シグマ・アルドリッチ	G5150
ホモジナイザー(FastPrep-24 5G)	MPバイオメディカル	116005500
ハイグロマイシンB	コーニング	30-240CR
ルミノメーター(Autolumat LB 953)	ベルトルト	34622さん
ルミノメーターチューブ	コーニング	352054
ライシングマトリックス(S、2.0ml)	MPバイオメディカル	116925500
マイクロシリンジ (25 μl, 25 ga)	SGEの	3000
マイクロ遠心分離機	任意のサプライヤー	該当なし
ミドルブルック7H11寒天	BDバイオサイエンス	283810
ミドルブルック7H9スープ	BDバイオサイエンス	271310
ミドルブルックADCエンリッチメント	BDバイオサイエンス	212352
ミドルブルックOADCエンリッチメント	BDバイオサイエンス	212240
マイコバクテリウム・ボビス BCG lux	諸	該当なし
n-デシルアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	D7384-100G
オービタル振盪インキュベーター	任意のサプライヤー	該当なし
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ・アルドリッチ	P4417-100TAB
ポリソルベート80(Tween-80)	シグマ・アルドリッチ	P8074-500ミリリットル
スモールボックス	任意のサプライヤー	該当なし	暗い通気孔または非密封ボックスを推奨
ピンセット	任意のサプライヤー	該当なし	短くて細い先端/鈍い長いピンセット
ペトリ皿(94/15mm)	グライナー	633181
濾紙(94mm)	任意のサプライヤー	該当なし	フィットするようにカット

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